云南省精神分裂症患者关联基因检测*

任玉霞，周小龙，张海燕，高恒亮，陈继峰#

1)郑州大学生物工程系 郑州 450001

2)甘肃亚盛集团博士后科研工作站北京分站 北京 100101

精神分裂症是以基本个性、思维、情感和行为的分裂，精神活动与环境不协调为主要特征的一类最常见的精神疾病，是多基因遗传病[1-2]。近年来有一些报道[3-5]表明，谷氨酸能功能失调与精神分裂症相关，如亲离子型谷氨酸受体NR1、NR2A、KA1、GluR7及一些代谢型谷氨酸能受体亚单位mGluR3、GRID1等都与神经突触可塑性相关。此外，调节性G蛋白信号4、神经调节蛋白1、右旋氨基酸氧化酶(DAO)与DAO激活剂(DAOA)也与精神分裂症相关。根据目前与谷氨酸能受体系统相关基因在精神分裂症遗传学方面的研究及谷氨酸能功能不平衡假说的研究[6]，作者选择了谷氨酸递质系统中的4个基因的4个 SNPs位点即:mGluR3基因 GRM3(位点rs2299225)、NR1 基因 GRIN1(位点 rs11146020)、GRID1基因(位点rs2814351)和DAOA基因G72/G30(位点rs778293)进行了研究，观察以上位点与精神分裂症的关联性。

1 材料与方法

1.1 试剂与样本来源 HotMaster酶、dNTPs均由北京天根公司提供，所有引物均由北京奥科生物技术有限公司合成，核酸外切酶Ⅰ与虾碱性磷酸酶(SAP)购自 Fermentas公司，biotin-14-dCTP与 TSP酶购自Invitrogen公司，dATP、dGTP、dTTP购自宝生物工程有限公司，碱性磷酸酶链霉亲和素购自北京鼎国生物技术有限公司，去离子甲酰胺为Sigma公司生产，BCIP/NBT购自Amresco公司。病例组及对照组血样来自云南省红河精神病院。两组样本DNA的提取由云南大学完成。病例组样品共255个，其中女性80个，男性175个，患者年龄27～55(41.4±10.0)岁。对照组样品共262个，其中女性101个，男性161个，对照年龄26～57(40.3±10.0)岁。所有患者均符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSM2Ⅳ)精神分裂症的诊断标准，排除合并严重器质性疾病及精神活性物质滥用者。对照者均排除精神疾病，且家族中无精神疾病及自杀者，个体间无血缘关系。

1.2 引物设计 针对每个SNP设计一对PCR引物(PF/PR)、一对等位基因特异性引物延伸(allelespecific primer extension，ASPE)引物(其 5’端 24 个碱基为标签tag序列)和一对反义标签(anti-tag)。tag与anti-tag选自美国Luminex公司的一套设计，为互补序列，长度均为24个碱基。全部引物和标签的名称及序列见表1。

表1 引物和标签序列

1.3 SNP位点的扩增

1.3.1 PCR 以总基因组为模板，PCR扩增包含SNP位点的 DNA片段。PCR反应体系50 μL，含1 × PCR Buffer，dNTPs 0.2 mmol，引物 PR、PF 各 0.2 μmol，HotMaster酶2.5 U，DNA 40 ng。反应条件:94℃预变性10 min;94℃变性40 s，54℃退火1 min，72℃延伸90 s，35个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。取PCR扩增产物5 μL，行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。

1.3.2 ASPE反应 在ASPE反应之前，先用核酸外切酶Ⅰ9 U和SAP 4.5 U对上述PCR产物进行处理;反应条件为37℃ 20 min，80℃ 20 min;反应体系为 100 μL，含 dATP、dGTP、dTTP 各 5 μmol，模板为上步 PCR 反应产物 45 μL，biotin-14-dCTP 3.2 μmol，TSP 酶 2.5 U，10 × PCR Buffer 5.5 μL，Mg2+0.75 mmol。ASPE反应条件:96℃预变性2 min;94℃变性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35 个循环;4℃保存。产物纯化:在ASPE反应产物中加200 μL 预冷无水乙醇，3 mol/L NaAC 10 μL 于 －80℃ 30 min离心后弃上清;加500 μL体积分数70%乙醇，再离心弃上清;用体积分数70%乙醇清洗，吹干后加40 μL双蒸水溶解。

1.4 杂交及基因分型 参照Koo等[7]的方法建立了简易微阵列法。取4个位点的anti-tag溶液0.5 μL(100 μmol/L)，固定在醋酸纤维素膜上，加预杂交液2.5 mL，37℃预杂交2 h;换杂交液(去除鲑鱼精的预杂交液)2.5 mL，40 μL ASPE 反应产物，37℃杂交 4 h;用洗涤液 1(0.1 × SSC，pH7.0，1 g/L SDS)于37℃洗涤4次，每次10 min;用蒸馏水淋洗1 遍后加入封闭液(20 g/L BSA，0.1 mol/L NaCl，12 g/L Triton-100，0.1 mol/L Tris-HCl pH7.5)3 mL，封闭1 h;加入碱性磷酸酶链霉亲和素(1.0 g/L)3 μL，37℃孵育 30 min;加入洗涤液 2(0.1 mol/L Tris，pH7.5，0.15 mol/L NaCl，3.3 g/L Tween 20)于37℃洗涤4次，每次5 min;加入检测平衡液(0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L MgCl2)，37℃，10 min。以上步骤均在摇床上匀速摇动进行。最后，加入BCIP/NBT显色液250 μL，于室温、黑暗且静止条件下显色反应。根据杂交信号结果，对SNP位点进行基因分型。

1.5 统计学处理 基因型数据采用SHEsis在线分析软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，单位点及等位基因的遗传关联分析。采用χ2检验比较病例组与对照组各SNP的基因型和等位基因频率的差异，检验水准α=0.05/位点数。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 对照组rs2299225、rs11146020、rs2814351 和 rs778293 位点均符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡 (χ2=2.802、2.579、0.684 和1.095，P 均 ＞0.05)。

2.2 2组4个位点基因型及等位基因频率比较见表2～5。

表2 2组rs2299225基因型及等位基因频率比较 例(%)

表3 2组rs11146020基因型及等位基因频率比较 例(%)

表4 2组rs2814351基因型及等位基因频率比较 例(%)

表5 2组rs778293基因型及等位基因频率比较 例(%)

3 讨论

Chen等[8]的研究发现中国精神分裂症患者与对照之间rs2299225等位基因频率存在差异。Albalushi等[9]对日本人群的研究发现rs2299225位点与精神分裂症有关联。该研究显示rs229925位点与精神分裂症有关，是否与样品类型有关有待进一步研究。Zhao等[10]在中国汉族群体中发现rs11146020(1001G/C)的C等位基因在患者组中高频表达。Martucci等[11]在加拿大多伦多人群研究中未发现GRIN1基因与精神分裂症有显著关联。该研究结果与Martucci等的研究结果一致。Guo等[12]在中国北方汉族人群中对GRID1的研究中发现位点rs2814351与精神分裂症有关联，而该研究未发现有关联。同一多态性位点出现了不同的研究结果，可能与样本的异质性或样本数量有关。

关于G72/G30的基因研究有许多报道，普遍认为该基因与精神分裂症显著相关[13]，韩燕等[14]的研究结果是DAOA基因区域rs778294的一个等位基因(C)与精神分裂症相关，而位点rs778293与精神分裂症无关。该研究结果显示rs778293位点与精神分裂症有关，与韩燕等的研究不一致，但也支持G72/G30基因可能与精神分裂症具有关联性的观点。G72/G30是人类特异性基因。已有研究[15]显示G72基因表达在精神分裂症患者脑前叶有所升高。以上研究表明，进一步研究G72/G30的SNP位点对精神分裂症的研究具有重要意义。

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