细胞直接共培养模型在大鼠肺成纤维细胞转分化中的应用*

曾 鑫，王永星，姚 武，付晓丽，郝长付#

1)郑州大学药学院 郑州 450001

2)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学与职业病学教研室 郑州 450001

转分化是指一种分化完全的细胞由于某些因素作用，丢失其原有表型特点而转变为其他类型细胞的一种特定的生理或病理过程[1]。在矽肺发生过程中，SiO2可刺激肺泡巨噬细胞分泌各类活性介质，尤其是转化生长因子TGF-β1，诱导肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，其α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及胶原蛋白(COL)表达上调，凋亡受到抑制，促进细胞增殖和胶原合成，最终引起肺纤维化[2-3]。以往在肺成纤维细胞转分化的研究中多采用细胞间接共培养法即将巨噬细胞、成纤维细胞分别培养，再用巨噬细胞上清刺激成纤维细胞。细胞直接共培养方法则是借助Trans-well小体将两种细胞进行共培养。该研究中作者分离了SD大鼠肺巨噬细胞和成纤维细胞，采用ThinCertTM建立直接共培养模型，加入不同质量浓度的SiO2，观察肺成纤维细胞转分化的过程，确定直接共培养模型的价值，为进一步研究肺成纤维细胞转分化的表观遗传学调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级成年雄性SD大鼠购自河南省实验动物中心，许可证号为SCXK(豫)2010-0002。游离SiO2粉尘标准品(粒径为1～5 μm，美国Sigma公司)，180℃恒温下烘烤4 h，用DMEM培养液(索莱宝公司)制成粉尘悬液(1 g/L)，4℃贮存备用。

1.2 大鼠肺成纤维细胞的提取和纯化 参照严玉兰等[4]方法。

1.3 大鼠肺巨噬细胞的提取、纯化和活性鉴定 参照丁焕然等[5]的方法提取大鼠肺巨噬细胞，然后加入不同质量浓度的SiO2粉尘悬液处理，采用MTT法检测巨噬细胞活性，确定后续实验中SiO2的质量浓度。

1.4 ThinCertTM共培养 取5～8代的成纤维细胞接种于6孔板，细胞生长融合至80% ～90%时，在ThinCertTM内接种约1×106个巨噬细胞，悬挂于6孔板孔内。

1.5 实验分组 实验分4组:空白组加入无SiO2粉尘的培养基;SiO2低、中、高剂量组在ThinCertTM内加入终质量浓度分别为25、50和100 mg/L的SiO2粉尘悬液，每孔2 mL，放入培养箱中，37℃、体积分数5%CO2及饱和湿度条件下培养24 h。

1.6 大鼠肺成纤维细胞α-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA的检测 采用real time-PCR。用Trizol法提取大鼠成纤维细胞的总RNA，逆转录为cDNA。内参GAPDH引物序列为上游5’-GGTGCTGAGTAT GTCGTGGAGT-3’，下 游 5’-CAGTCTTCTGAGTG GCAGTGAT-3’，产物292 bp;α-SMA引物序列上游5’-AGCCAGTCGCCATCAGGAAC-3’，下游 5’-GGG AGCATCATCACCAGCAA-3’，产物 127 bp;COLⅠ引物序列，上游5’-GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC-3’，下游 5’-GGGACCCTT AGGCCATTGTGTA-3’，产物 119 bp;COLⅢ引物上游 5’-TTTGGCACAG CAGTCCAATGTA-3’，下 游 5’-GACAGATCCCG AGTCGCAGA-3’，产物121 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。反应体系20 μL:cDNA 模板 1 μL，Priemix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件为:95℃10 min，95℃10 s，59℃(GAPDH)或58℃(α-SMA)或58℃(COLⅠ)或57℃(COLⅢ)30 s，72℃ 30 s，40个循环。每个样品平行测定3 次，用 2－ΔΔCt法计算目的基因的表达量。

1.7 培养上清中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ蛋白的检测 采用双抗体夹心ABC-ELISA法，ELISA试剂盒购自美国R＆D公司。收集培养上清，按试剂盒说明书操作，先用标准品绘制出标准曲线，再求出待测样品中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ质量浓度。每个样品平行测定6次。

1.8 统计学处理 采用SPSS 12.0处理数据。4组间肺成纤维细胞中α-SMA、COLⅠ和 COLⅢmRNA的表达量和培养上清中上述3指标质量浓度的比较采用单因素方差分析，两两比较应用 Dunnet’t检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 4组肺成纤维细胞中α-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA的表达量 见表1。

表1 4组肺成纤维细胞中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ mRNA的表达量

2.2 4组培养上清中α-SMA、COLⅠ和 COLⅢ质量浓度的比较 见表2。

表2 4组培养上清中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ质量浓度的比较 μg/L

3 讨论

矽肺是尘肺病中危害最严重的一种，长期吸入SiO2粉尘导致肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞是矽肺发病重要的细胞基础已为大量国内外研究[2-3，6]所证实。粉尘吸入肺内，最先受到损伤的是肺巨噬细胞，巨噬细胞产生大量的致纤维化细胞因子作用于肺成纤维细胞，产生大量的细胞外基质成分，从而导致肺间质纤维化。而肺成纤维细胞在正常静息状态下不具有过度增殖和分泌能力，发生活化、功能改变是细胞转分化的结果[7]。在肺纤维化发生时，COLⅠ、COLⅢ蛋白的变化成为反映细胞外基质蛋白成分变化的主要指标[8]。成纤维细胞α-SMA、COLⅠ、COLⅢ蛋白含量增加，提示成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，是纤维化的标志。

以往矽肺纤维化研究多采用间接共培养方法[9]，即从肺部分离巨噬细胞进行培养，用SiO2刺激巨噬细胞所得的培养上清液作用于肺成纤维细胞，这种方法在时间与空间上都与体内存在较大的差异。ThinCertTM共培养模型即直接用SiO2刺激ThinCertTM内的巨噬细胞，促进其分泌大量细胞因子(白细胞介素、干扰素、TGF-B1、肿瘤坏死因子-α等)，同步作用于成纤维细胞，这种模型更好地模拟了体内环境。该研究结果显示，ThinCertTM共培养方式下，SiO2各处理组 α-SMA、COLⅠ、COLⅢ mRNA和蛋白的表达量均高于对照组，且随SiO2质量浓度的增加而升高，表明ThinCertTM共培养方式成功模拟了肺成纤维细胞转分化的过程，用 ThinCertTM共培养方式建立的体外细胞模型在肺成纤维细胞转分化研究中有应用价值。

[1]Slack JM，Tosh D.Transdifferentiation and metaplasia—switching cell types[J].Curr Opin Genet Dev，2001，11(5):581

[2]Zhao L，Xiao K，Wang H，et al.Thalidomide has a therapeutic effect on interstitial lung fibrosis:evidence from in vitro and in vivo studies[J].Clin Exp Immunol，2009，157(2):310

[3]Cutroneo KR，White SL，Phan SH，et al.Therapies for bleomycin induced lung fibrosis through regulation of TGF-beta1 induced collagen gene expression[J].J Cell Physiol，2007，211(3):585

[4]严玉兰，刘洋，步雪峰，等.鼠肺细胞的分离纯化及原代培养[J].江苏大学学报:医学版，2008，18(1):11

[5]丁焕然，马小兵，戴丽琴.二氧化硅对大鼠肺泡巨噬细胞和肺成纤维细胞TGF-β1表达的影响[J].工业卫生与职业病，2007，33(4):214

[6]胡永斌，曾庆富，彭劲武，等.二氧化硅影响人肺成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白表达的实验研究[J].中华劳动卫生职业病杂志，2006，24(9):523

[7]Phan SH.The myofibroblast in pulmonary fibrosis[J].Chest，2002，122(6 Suppl):286S

[8]李才.器官纤维化基础与临床[M].北京:人民卫生出版社，2003.

[9]马海燕，王国根，宋志芳.矽肺纤维化体外细胞模型的建立[J].中华劳动卫生职业病杂志，2001，19(4):289