AG490对前列腺癌DU145细胞增殖及STAT3信号通路相关蛋白表达的影响*

张 嵩，郝 斌#，李惠翔，张海鹏

1)郑州大学第二附属医院泌尿外科 郑州 450014

2)郑州大学第一附属医院病理科 郑州 450052

前列腺癌是老年男性常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，在欧美地区的发病率很高。随着我国人民饮食结构、生活条件及人口老龄化的改变，前列腺癌的发病率逐渐增加[1]。已知信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路的异常活化在肿瘤的发生发展中起着重要的促进作用，而JAK2激酶的异常激活是 STAT3 信号通路活化的起源[2]。研究[3]显示，α-氰基-(3，4-羟基)N-苄苯乙烯胺(AG490)为 JAK2激酶抑制剂，能够有效阻断STAT3信号通路的活化，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进其凋亡。作者观察了AG490对前列腺癌DU145细胞增殖及STAT3信号通路相关蛋白表达的影响，以进一步探究其抗癌机制。

1 材料与方法

1.1 材料 DU145细胞购自武汉博士德生物工程有限公司。AG490购自德国Biosciences Inc公司，噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，Western blot所需的蛋白提取试剂盒和抗磷酸化 JAK2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化 STAT3(p-STAT3)、Cyclin D1及BCL-xL抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 细胞增殖抑制率观察 DU145细胞在含体积分数10%新生牛血清+100 U/mL双抗(青霉素+链霉素)的DMEM高糖培养基，37℃、体积分数5%CO2下培养24 h后，取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔1×104个。继续培养24 h后分组，每组6个复孔，对照组单纯用DMEM高糖培养基培养，AG490各浓度组分别加入终浓度为10、25、50及80 μmol/L 的 AG490，继续培养 24、48、72 h 后每孔加入15 μL 5 g/L的MTT，37℃继续孵育4 h后终止培养，弃上清，每孔加入150 μL DMSO。上机检测490 nm波长处的吸光度值(A)，细胞增殖抑制率=(1－实验组A值/对照组A值)×100%。

1.3 STAT3信号通路相关蛋白的检测 采用Western blot法。细胞同上分组处理，培养至72 h，使用核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜，滤膜经脱脂奶粉37℃封闭1 h后，分别加入按1∶1000稀释的一抗p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1 及BCL-xL后4℃孵育过夜，TTBS洗膜3次，每次10 min，加入碱性磷酸酶标记的二抗，37℃孵育1 h，TTBS洗膜3次，暗室内ECL显色，X光片曝光成像。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0处理数据。采用3×4析因设计的方差分析比较AG490作用时间和剂量对DU145细胞增殖抑制率的影响，检验水准α =0.05。

2 结果

AG490处理后DU145细胞增殖抑制率的比较见表1，STAT3信号通路相关蛋白的表达见图1。

表1 不同剂量AG490处理不同时间DU145细胞的增殖抑制率(n=6) %

图1 不同剂量AG490作用72 h后DU145细胞STAT3信号通路相关蛋白的表达

3 讨论

STAT3在正常组织细胞信号转导中激活速度快且作用时间短暂。Rivat等[4]研究发现许多人类恶性肿瘤中存在STAT3信号通路过度激活与表达。JAK2是STAT3信号通路中的上游激酶，其活化后能募集胞质中的STAT3单体，使STAT3分子酪氨酸磷酸化，从而快速激活STAT3信号通路产生相应的生物学效应[5-6]。AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈脂类衍生物，结构与酪氨酸类似，通过与受体酪氨酸激酶竞争结合位点，从而抑制JAK2/STAT3信号转导，进而抑制肿瘤的生长和转化。现在AG490已广泛应用于多种肿瘤的治疗，如白血病、肝癌[7-8]等。

该研究结果显示，AG490作用于DU145细胞后，细胞增殖明显受抑，抑制率最高接近80%。同时，AG490还能抑制STAT3信号通路相关蛋白的表达。推测p-JAK2及p-STAT3的表达减少致靶基因中的细胞调控基因Cyclin D1及凋亡抑制基因BCL-xL的蛋白表达降低，使细胞周期停滞及凋亡增加，从而有效阻断STAT3信号通路，抑制肿瘤增殖。此外，Ueda等[9]研究发现AG490除抗肿瘤作用外，还能抑制雄激素受体的激活，抑制率高达85%，因此更加适合前列腺癌的治疗。

综上所述，AG490能抑制前列腺癌DU145细胞的增殖，其机制可能与其阻断STAT3信号通路有关。AG490有望成为前列腺癌化疗的全新药物。

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