抗抗总黄曲霉毒素单抗F(ab’)2多克隆抗体的制备及特性

刘智勇，孙锦峰

1)鹤壁市卫生监督中心 鹤壁 458030

2)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001

黄曲霉毒素(aflatoxin，AFB)是由寄生曲霉和产毒的黄曲霉污染粮油及其制品、饲料所产生的有毒次生代谢产物。黄曲霉毒素 B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性最强，污染最为严重，是自然界存在的最严重的化学致癌物之一。许多国家和地区都规定了食品及饲料中AFB1的最大允许含量，并作为强制性标准进行检测和控制。我国对AFB1的污染和控制也非常重视。目前常应用抗AFB1单克隆抗体(单抗)的免疫分析方法测定AFB1，但因在检测过程中必须频繁接触较高浓度的AFB1标准品，导致很多检测人员具有很强的心理戒备。另外，由于发达国家对毒素标准品的禁运，我国很难得到AFB1标准品，使得食品及饲料中AFB1的检测分析受到限制。利用Jerne的免疫网络学说[1-3]可知抗独特型抗体(Ab2)在空间构象上与抗原存在内影像关系，能替代原始抗原，因此利用抗黄曲霉毒素单抗的F(ab’)2片段可制备出抗抗黄曲霉毒素单抗独特型抗体，后者有望作为AFB1标准品的替代品用于AFB1的无毒免疫学检测。作者采用多克隆抗体(多抗)的制备方法生产出抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型抗体，并对其特性进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器 SephacrylTMS-200分子筛凝胶和甘氨酸(美国Amersham公司)，无花果蛋白酶、AFB1、牛血清白蛋白、血蓝蛋白(KLH)、辣根过氧化物酶(HRP)、戊二醛和正辛酸(美国Sigma公司)，硫酸铵(北京化学试剂公司)，HRP标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG(北京欣经科生物技术公司)，96孔可拆分酶标板(美国Gibco公司)。抗总黄曲霉毒素单抗、抗赭曲酶毒素(OA)单抗、抗T-2毒素单抗、抗河豚毒素(TTX)单抗均由作者制备。低温高速离心机(德国HermLe公司)、SUNRISE酶标分析仪(瑞士Tecan公司)、AKTA快速蛋白液相色谱系统(美国Amersharm公司)。

1.2 实验动物 健康雄性日本大耳白兔3只，健康雌性日本大耳白兔1只，体质量1.0～1.5 kg，购自北京富豪动物养殖中心[SCXK(京)2000-0019];6～8周龄雌性未经产BALB/C小鼠3只，购自军事医学科学院。

1.3 抗总黄曲霉毒素单抗2G2株F(ab’)2片段的制备 用无花果蛋白酶酶切辛酸-饱和硫酸铵两步沉淀法纯化[4]所得的抗总黄曲霉毒素单抗2G2株腹水(均由郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室制备)，采用分子筛凝胶过滤法经快速蛋白纯化仪(FPLC)分离纯化酶切片段，得到单抗F(ab’)2片段，经特性鉴定后－20℃冻干保存。

1.4 大分子免疫原F(ab’)2-KLH的制备 采用戊二醛一步法。将1 mL F(ab’)2片段与含20 mg纯KLH的冻干粉末溶解于适量硼酸缓冲液(pH 10.0)中，然后缓慢加入新鲜配制的1 mL体积分数0.3%戊二醛溶液，室温避光放置2 h，期间轻轻搅拌，加入1 mol/L甘氨酸终止未反应的戊二醛，静置30 min。加20倍体积的硼酸缓冲液(pH 8.5)透析过夜，每4 h换液1次。

1.5 免疫血清的制备和纯化 取F(ab’)2-KLH及F(ab’)2片段(均为1 g/L)，各加等体积的CFA充分乳化后，分别于家兔背部皮下多点注射免疫。首次免疫后间隔3周，再以1 mL免疫原(0.5 g/L)加等体积IFA乳化后，注入皮下多点加强免疫。而后，每隔2周按第二次免疫法重复加强免疫。每次免疫前抽少许静脉血，分离血清，采用抗体包被酶标板检测抗体滴度，待抗体滴度达到平台期后，以250 μg免疫原耳缘静脉免疫，3 d后颈动脉放血处死。血液于4℃环境下放置，约1 h，使血块凝固收缩，收集析出的血清，剩余血块全部倾入离心管，在常温下2500 r/min离心30 min，取上清液与前面的血清混合，分装成1 mL/管，－20℃保存。

1.6 单抗-HRP复合物的制备 采用过碘酸钠法。分别将HRP与抗总黄曲霉毒素单抗、抗赭曲酶毒素单抗、抗T-2毒素单抗和抗河豚毒素单抗连接。在1.2 mL纯水中溶解5 mg HRP，加入新配制的0.1 mol/L 过碘酸钠(pH 7.0)0.3 mL，置室温 20 min。在1 mmol/L醋酸钠(pH 4.0)中4℃透析24 h，期间更换透析液数次。用0.02 mol/L碳酸钠溶液(pH 9.5)制备抗体样品至10 g/L。将0.5 mL抗体加至经透析的HRP溶液中，置室温2 h。加入100 μL硼氢化物(4 g/L)，置4℃ 2 h。在PBS内透析，于－20℃保存备用。

1.7 抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多抗的性质测定

1.7.1 一般特性检测 以包被量为0.625 g/L的AFB1-BSA作为包被抗原，采用间接竞争ELISA法检测2种免疫原制备所得的兔血清的灵敏度(采用抑制率质量浓度表示，即达到20%、50%和80%竞争抑制时兔血清的质量浓度)，选用灵敏度较好的一种兔血清，采用辛酸-饱和硫酸铵两步沉淀法纯化。以羊抗兔 IgG为包被抗原，用间接非竞争ELISA法检测兔IgG含量。分别以AFB1-BSA、T-2-BSA、OA-BSA、TTX-BSA为包被抗原，以合适质量浓度的相应单抗-HRP复合物作为反应抗体，以梯度质量浓度的兔多抗血清作为竞争抗原，采用直接竞争法检测交叉反应，鉴定抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多抗的特异性。

1.7.2 与 AFB1镜像关系检测 ①替代游离AFB1:以包被量为0.625 mg/L的 AFB1-BSA作为包被抗原，以合适质量浓度的2G2单抗作为反应抗体，不同稀释度的兔多抗血清和AFB1作为竞争抗原，在相同体系下采用间接竞争ELISA法检测各自竞争2G2单抗上AFB1结合位点的能力。②替代AFB1包被抗原:分别以经辛酸-饱和硫酸铵两步沉淀法纯化的兔多抗血清(包被量为2.3 mg/L)和AFB1-BSA(包被量为0.625 mg/L)作为包被抗原，不同稀释度的兔多抗血清和游离AFB1作为竞争抗原，与等体积合适质量浓度的2G2-HRP 4℃混合过夜后，次日100 μL/孔加入酶标板，采用直接竞争ELISA法检测竞争抑制情况。

1.7.3 Ab2β亚型的鉴定 采用小鼠生物学法。将兔血清用8.5 g/L生理盐水稀释成1 g/L，首次用200 μL(即200 μg)兔血清加等体积的CFA充分乳化后免疫BALB/C小鼠，右侧腹腔注射，2周后用0.5 g/L的兔血清 200 μL(即 100 μg)加等体积的IFA充分乳化后加强免疫，而后，每隔2周按第二次免疫法重复加强免疫。免疫3次后取小鼠内眦静脉血，以0.625 g/L的 AFB1-BSA为包被抗原，检测抗体滴度。

2 结果

2.1 抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多抗的一般特性 F(ab’)2及F(ab’)2-KLH免疫所得的多抗的蛋白含量分别为40和70 g/L，20%、50%和80%竞争抑制时的质量浓度分别为 1.00、4.00、25.00、7.00、43.75 和 233.33 mg/L。该多抗与抗 T-2 单抗、抗OA单抗和抗TTX单抗交叉反应均＜0.1%。

2.2 抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多抗与AFB1的镜像关系 制备的抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多抗纯化后，替代游离AFB1达到20%、50%和80%竞争抑制时的质量浓度分别为1、4和25 mg/L，分别相当于0.47、2.74 和16.00 μg/L 游离 AFB1;该抗体替代AFB1包被抗原达到20%、50%和80%竞争抑制时的质量浓度分别为1、4和19 mg/L，分别相当于0.33、1.35 和5.45 μg/L 游离 AFB1。

2.3 抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多抗亚型的鉴定 生物学鉴定小鼠血清稀释度曲线见图1。由图1可见，在多抗质量浓度达到2 g/L时OD(460 nm)值明显增高，可知所得多抗为Ab2β亚型。

图1 Ab2β亚型鉴定曲线

3 讨论

独特型抗体是指具有独特型抗原决定簇的抗体，而Ab2是指针对独特型抗体的独特型抗原决定簇产生的抗体。根据 Ab2的特点和功能可分为Ab2α、Ab2β、Ab2γ 及 Ab2δ 4 种不同类型，只有Ab2β型是由位于异种抗体(Ab1)的抗原结合位点的独特型决定簇产生的抗体，根据抗原抗体在空间构象上互补的特点，即独特型抗原决定基和抗原的结合部位相同，Ab2β中存在所谓的抗原内影像，可替代抗原用于免疫学分析[5-6]。

Ab2的制备方法有传统的免疫学方法即多抗或单抗的制备以及基因工程方法[7]。常规方法是用完整抗体充当免疫原进行制备，但完整IgG具有以下局限:抗体的Fc段因能与正常细胞膜上的Fc受体结合而降低了单抗的特异性;大分子抗体的穿透力不强，反应时空间位阻大;在异种免疫制备Ab2时，具有种属特异性的抗体Fc段免疫原性较强，产生的多是针对Fc的抗体，而针对具有抗原特异性的Fab的抗体较少。因此，制备去除抗体Fc段而保留有抗原结合能力的F(ab’)2或Fab片段，具有重要的意义。以Ab1免疫动物获得血清多抗时，产物中除了Ab2外还含有抗同种型和抗同种异型决定簇的抗体，而且由于同种型决定簇的免疫原性比独持型要强，因而产生的Ab2也主要为抗同种型抗体和抗同种异型抗体[8-10]。为了最大程度地得到Ab2，作者采用了基本剔除了抗同种型和抗同种异型决定簇的Ab1 F(ab’)2片段作为免疫原制备Ab2，得到了灵敏度和特异性较好的Ab2多抗[11]。但在研究中发现，采用戊二醛一步法连接大分子蛋白KLH的F(ab’)2片段免疫所得的Ab2虽然具有较高的抗体滴度，但是灵敏度较差，原因可能在于采用戊二醛一步法连接时KLH掩盖了Ab1 F(ab’)2的抗原决定簇部位，虽然大分子免疫原能产生很高滴度的抗体，但抗独特型抗体所占的比例很少，大部分是针对KLH和F(ab’)2恒定区的抗体。因此，如要提高抗体免疫原性还需探索。

作者采用经典的间接竞争ELISA法检测制备的抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多抗，发现可替代线性范围为0.03 ～10.00 μg/L 的游离 AFB1。而当将该抗体作为包被抗原时，开始采用间接竞争ELISA法检测，发现阴性空白值始终偏高，检测系统可信度不高，原因可能为包被抗原是多抗，酶标的羊抗兔二抗也是多抗，交叉反应较为严重。作者将单抗联结HRP，采用直接竞争一步法进行检测，以避免交叉反应的发生，以抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多抗作为包被抗原，可替代线性范围为 0.02 ～10.00 μg/L 的游离AFB1。经过小鼠生物学鉴定，ELISA检测可知获得的抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多克隆抗体可产生滴度较高的Ab3抗体，证实为Ab2β型。

该研究通过抗总黄曲霉毒素单抗F(ab’)2片段免疫日本大耳白兔制备出的模拟AFB1内影像的抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多抗，可作为AFB1的替代物，为进一步研究和开发具有我国自主知识产权的无毒检测试剂盒积累了重要资料。

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