油棕猝倒病菌实时荧光PCR检测方法

张慧丽， 王建峰， 段维军， 徐 瑛， 高姗姗， 陈先锋＊

（1.宁波出入境检验检疫局，宁波 315012；2.宁波大学，宁波 315211）

华丽腐霉（Pythium splendens Braun）引起的油棕猝倒病是油棕上的一种重要真菌病害［1］，该病菌寄主范围很广，除侵染油棕苗以外，还能危害上百种经济作物，引起寄主幼苗整株失水萎蔫［2］。它主要分布在比利时、法国、德国、意大利、荷兰、日本、坦桑尼亚、刚果和美国的夏威夷、佛罗里达、宾夕法尼亚州，国内台湾、海南曾有报道［2－4］，但其他地区未见发生报道。该病菌通过带菌土壤、生长介质和营养繁殖材料传播。在2007年被列入中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录。针对P.splendens的检 测 已 有 特 异 性 引 物［5］、PCR－RFLP［6］、核 糖 体DNA序列分析［4］等方法。随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR以其具有的高特异性、高灵敏度以及快速的优点越来越多地应用于疫病的检测。

真核生物核糖体 DNA（rDNA）由18S、ITS1（internal transcribed space）、5.8S、ITS2 和 28S构成，头尾串联形成重复序列，一个基因组内有60～200个拷贝。ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8SrDNA基因也被包括在ITS之内。rDNA上5.8S、18S和28SrDNA基因序列进化缓慢而相对保守，但这三个基因序列之间的ITS序列的进化则相当迅速，因而rDNA序列广泛用于真菌各级水平的系统学研究［7］。本研究通过对病原菌及相关种的rDNA ITS序列进行比较分析，设计了针对P.splendens的引物和探针，建立了P.splendens实时荧光PCR检测方法，为口岸检验检疫提供快速、准确的检测技术。

1 材料和方法

1.1 菌株

供试菌株包括了腐霉属12种、疫霉属2种以及一些常见真菌、细菌共17种21个菌株。菌株编号和来源见表1。

表1 参试菌株及来源

1.2 DNA提取

将供试真菌菌株采用CTAB法提取总DNA［8］，细菌菌株采用TaKaRa minibest bacterial genomic DNA extraction kit ver.2.0 试 剂 盒 提 取 DNA，－20℃保存备用。

1.3 PCR检测

1.3.1 引物及探针的设计与合成

使用Bioedit软件对GenBank中的病原菌及相关种的rDNA ITS序列进行比较分析，找出保守序列，应用 Primer Express 5.0设计P.splendens的引物和探针。实时荧光PCR引物pyspF序列为5′－TTAAATGGACAGGGTCTTTCTAT－3′， pyspR序 列 为 5′－TGCCGAAGTCGCCAAAAG－3′，Taqman探针 pyspT 序列为5′－CGAGCACCACACTTCACACAG－3′，探针5′端标记的荧光报告基团为FAM，3′端标记的荧光猝灭基团为TAMRA。荧光探针与引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.3.2 实时荧光PCR反应体系和程序

PCR反应总体积为25μL，各成分为：1×Premix Ex TaqTM（大连宝生物），引物0.5μmol／L，探针0.2μmol／L，校正荧光 ROX 0.2μmol／L。在ABI 7900定量PCR仪（美国ABI）上进行PCR反应。反应条件为：50℃预热2min；95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。实时荧光PCR利用ABI 7900型荧光定量PCR仪自带软件SDS3.0（版本号）进行结果分析，根据阴性对照结果设定阈值线，扩增曲线及样品Ct值由软件自动生成。

1.3.3 特异性检测

以表1中菌株的基因组DNA为试验材料，用P.splendens的种特异性引物PyspF／PyspR及探针PyspT行实时荧光PCR检测，并设置空白对照。

1.3.4 灵敏度检测

为确定油棕猝倒病菌实时荧光PCR的检测限度，将菌株 ATCC96757 的 DNA 稀 释 成12、1.2、0.12、0.012、0.001 2、0.000 12、0.000 012、0.000 001 2ng／μL 8个不同浓度，分别用引物PyspF／PyspR及探针PyspT进行实时荧光PCR检测。

2 结果与分析

2.1 华丽腐霉的特异性检测

对表1所列供试菌株进行实时荧光PCR检测结果表明，只有P.splendens的5个菌株的模板检测到信号增加，扩增反应呈阳性，而其他参试菌株及空白对照在40个扩增周期内未见信号增长，扩增反应呈阴性（图1）。实时荧光PCR特异性良好。

图1 油棕猝倒病菌实时荧光PCR特异性扩增结果

2.2 灵敏度检测试验

对不同稀释度的P.splendens DNA样品，采用实时荧光PCR检测，结果表明，实时荧光PCR方法对低至0.012pg／μL的DNA样品有明显扩增（图2），系列稀释的扩增曲线的Ct值在12～38之间，扩增曲线典型。方法的重复性良好。同时，DNA稀释度与Ct值呈良好的相关性，其相关系数0.999 5，相邻10倍稀释度的Ct值差为3.58左右（图3），结果可靠。

3 讨论

一直以来，形态学分类在腐霉分类中占主要地位，近年来随着分子生物学技术的发展，生物技术已经逐渐成为腐霉属菌物分类的一种重要的辅助工具，应用于P.splendens的分子方法包括特异性引物、PCR－RFLP、核糖体DNA序列分析等。形态学鉴定有经验性强、耗时长等缺点；已有的分子生物学方法中特异性引物的灵敏度不高，在研究过程中我们采用 Wang等［6］设计的特异性引物对DNA浓度为12ng／μL的样品进行检测，结果无扩增。PCRRFLP需要PCR扩增后再进行后续检测，耗时较长；核糖体DNA序列分析，扩增好的PCR产物需要送到专业公司进行测序，虽然获得的信息量大，但是耗时更长。而实时荧光PCR检测方法正好克服了以上的缺点，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需PCR后处理等优点。目前，还未见P.splendens实时荧光检测方法的报道。本研究建立的实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高。符合口岸检测快速、准确的要求。

［1］ Aderungboye F O，Esuruoso O F.Ecological studies on Pythium splendens Braun in oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）plantation soils［J］.Plant and Soil，1976，44（2）：397－406.

［2］ CMI.Descriptions of pathogenic fungi and bacteria［M］.Commonwealth Mycological Institute，Kew，United Kingdom，1966，No.120.

［3］ Fu C H，Chen C M，Hsieh H J.First report of formosan michelia seedling root rot caused by Pythium splendens in Taiwan［J］.Plant Disease，2005，89（12）：1361.

［4］ 陈秀贤，曾会才，何汉兴，等.海南腐霉新记录种Pythium splendens的鉴定及其对油棕苗的致病性测定［J］.云南农业大学学报，2008，23（3）：321－324.

［5］ Wang P H，Wang Y T，White J G.Species－specific PCR primers for Pythiumdeveloped from ribosomal ITS1region［J］.Letters in Applied Microbiology，2003，37（2）：127－132.

［6］ Wang P H，White J G.Molecular characterization of Pythium species based on RFLP analysis of the internal transcribed spacer region of ribosomal DNA［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，1997，51（2）：129－143.

［7］ 陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用［J］.安徽农业科学，2007，35（13）：3785－3786.

［8］ 易润华，朱西儒，周而勋.简化CTAB法快速微量提取丝状真菌DNA［J］.湛江海洋大学学报，2003，23（6）：72－73.