小菜蛾ISSR－PCR反应体系的建立与正交设计优化

杨家强， 王相晶， 郭兆将， 朱 勋， 吴青君＊，谢 文， 王少丽， 徐宝云， 张友军

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

简单重复序列间区（inter simple sequence repeat，ISSR）是由 Zietkiewicz等人［1］开发的一种基于SSR的分子标记。这种新型方法用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3′端或5′端加上2～4个随机核苷酸，扩增反向排列的间隔不太长的2个SSR之间的序列，可以通过PCR技术揭示基因组中微卫星序列的变异。与微卫星及其他分子标记相比，ISSR标记具有操作简单，DNA用量少，可重复性好，成本低，呈孟德尔遗传，无须预知研究对象的基因组序列等特点，其所揭示的多态性比RFLP、RAPD和SSR更高，具有广泛的应用前景。这种方法常被应用于亲缘关系鉴定［2－4］、种质资源和遗传多样性研究［5－7］，并被作为构建遗传图谱的工具［8］。

虽然ISSR－PCR具有重复性好的特点，但是IS－SR－PCR是基于PCR反应的分子标记方法，Mg2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度以及Taq酶和模板DNA用量都会影响ISSR－PCR反应扩增效果［9］，而且ISSR－PCR最佳反应体系在不同的物种中各不相同［10］。小菜蛾（Plutella xylostella）是影响十字花科蔬菜产量和质量最重要的害虫，因其繁殖率高、世代重叠严重、易产生抗药性，因此防治困难。Saw等利用mtCOI基因标记研究了澳大利亚小菜蛾，发现澳大利亚不同地理种群小菜蛾的mtDNA分化程度较低［11］。Endersby等通过对澳大利亚、新西兰等17个地区的小菜蛾进行SSR标记研究，发现澳大利亚小菜蛾种群与韩国、马来西亚种群存在较大的遗传分化［12］。由于ISSR－PCR各因素之间相互影响，为了保证ISSR－PCR结果的重复性和可靠性，必须搞清楚各因素之间的相互作用，所以非常有必要对小菜蛾ISSR－PCR反应体系进行优化，建立最佳反应体系。本文采用正交设计的方法，选用L16（45）正交表，从Mg2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度以及Taq酶和模板DNA用量5种因素4个水平对小菜蛾ISSR－PCR反应体系进行优化，在此基础上对退火温度及反应循环次数进行比较分析，建立了适用于小菜蛾的ISSR－PCR最佳反应体系，为小菜蛾的多态性分析和分子生态学研究提供试验支持，为利用分子标记技术进行抗药性及种群遗传关系的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

小菜蛾种群：在本实验室养虫室内用无虫甘蓝苗进行继代饲养，具体方法参见杨峰山等［13］，稍做改动。

1.2 基因组DNA的提取

采集小菜蛾成虫每3头为一管进行基因组DNA提取，提取方法按照TIANamp Genomic DNA Kit（TIANGEN BIOTECH CO.，LTD.）说明书进行。用琼脂糖凝胶电泳进行检测，Nanodrop 2000c分光光度计（Thermo Scientific公司）测定其浓度和纯度，并将DNA样品稀释至40ng／μL，用于ISSRPCR反应条件的优化试验。

1.3 优化ISSR－PCR反应体系的正交设计

为确定小菜蛾ISSR－PCR反应的最佳扩增条件，经初步筛选，引物886作为此次正交试验的引物，分别对 Mg2＋浓度、Taq DNA 聚合酶用量、dNTPs浓度、模板DNA和引物浓度用量5个主要影响因素各4个水平作正交试验。选用L16（45）正交表，设计PCR扩增体系各成分的因素－水平正交设计试验（表1，表2）。反应体系均为20.0μL，每管各加2.0μL 10×PCR Buffer（不含 Mg2＋），然后按照各组分母液浓度计算各因素用量，不足体积用无菌双蒸水补充，PCR产物用2.0%的琼脂糖电泳检测。结果依据琼脂糖电泳条带的强弱和杂带的多少做直观分析。

表1 ISSR－PCR反应体系的因素与水平

表2 ISSR－PCR正交试验设计［L16（45）］1）

1.4 ISSR－PCR的扩增反应

用于ISSR－PCR反应的 Mg2＋、dNTPs、ES Taq酶购自康为世纪公司，标准分子量（marker）200bp Ladder购自天根生物技术有限公司，引物参照加拿大British Columbia大学提供的ISSR引物序列［14］，Invitrogen公司合成。PCR反应在S1000型PCR循环仪（BIO－RAD公司）上进行。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，X℃（不同引物退火温度各异）退火1.0min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10.0min；10℃保存。反应结束后，扩增产物在质量浓度2.0%的琼脂糖凝胶上电泳分离，电压150V。在ChemiDocTMXRS＋凝胶成像系统（BIO－RAD公司）上观察并照相记录。利用Quantity one分析条带数目及明亮程度。

1.5 退火温度梯度筛选

利用以上正交试验建立的小菜蛾ISSR－PCR反应的最佳体系，从100个ISSR引物中根据Tm值上下浮动8.0℃设定退火温度范围，PCR仪自动生成温度梯度进行筛选，筛选出扩增稳定、重复性好的引物。对反应程序的循环次数进行优化。

2 结果与分析

2.1 直观分析法评分

小菜蛾正交ISSR－PCR产物电泳结果见图1，利用直观分析法［15］对16个处理从高到低依次打分，条带数量丰富、清晰度高、背景低的最佳产物记为25，与此相反，最差的记为1。从左至右依次的计分为：21、24、22、23、3、15、20、20、12、18、4、5、4、6、17、10；重复电泳的结果与第1个结果有较大的一致性，评分结果：22、24、23、22、4、13、21、21、11、17、3、5、3、5、15、9。

2.2 各因素影响ISSR－PCR反应的差异分析

采用DPS软件对结果进行方差分析，由F值可知Mg2＋对PCR反应影响最大，Taq酶最小。各因素水平变化对PCR反应影响从大到小依次为：Mg2＋、模板 DNA、dNTPs、引物、Taq酶，由于各因素水平间的差异均达到显著水平，需进一步做因素内多重比较。

图1 ISSR－PCR反应正交试验电泳结果

2.2.1 Mg2＋对小菜蛾ISSR－PCR体系的影响

对Mg2＋各水平间进行比较分析结果表明，Mg2＋浓度从1.5～3.0mmol／L扩增结果均值呈下降趋势，当 Mg2＋浓度为1.5mmol／L时均值最高，且与其他3个水平达到极显著差异水平，1.5mmol／L为Mg2＋最佳反应水平（图2）。

图2 不同因素与结果均值的关系

2.2.2 Taq酶对小菜蛾ISSR－PCR体系的影响

从方差分析可知，Taq酶对PCR扩增影响最小。对酶各水平比较分析表明，随着酶量的上升结果均值呈上升趋势，当酶量为3.5U时与其他3水平间的差异达到极显著水平，但酶量过高背景加深，且其他3个水平未达到显著差异（图2），综合考虑以2.5U水平为最佳反应水平。

2.2.3 dNTPs对小菜蛾ISSR－PCR体系的影响

dNTPs水平间比较的结果表明，随着dNTPs浓度从0.15～0.25mmol／L扩增结果均值增大，增加到0.30mmol／L时反而下降，浓度0.20mmol／L和0.25mmol／L未达到显著水平，但与其他两个水平差异显著（图2），综合考虑以0.20mmol／L水平为最佳反应水平。

2.2.4 模板DNA对小菜蛾ISSR－PCR体系的影响

从方差分析可知，模板DNA对PCR扩增影响很大。随着模板DNA浓度升高，扩增结果均值呈下降趋势，浓度为20ng时扩增结果均值最大且与其他水平的差异达到极显著水平，选择20ng为最佳水平（图2）。

2.2.5 引物对小菜蛾ISSR－PCR体系的影响

由方差分析可知，在0.50～1.25μmol／L内随着浓度的增加而升高，在1.25μmol／L时达到峰值（图2），与其他3个水平差异显著，因此选择峰值1.25μmol／L为最佳水平。

2.3 循环次数对小菜蛾ISSR－PCR体系的影响

循环次数对扩增产物的量具有重要的影响，循环次数不足，扩增产物量不足，部分谱带不能检测；反应到达平台期后，循环次数增多不会使产物明显增加，反而引起非特异性扩增，发生错配的比例比较高，引起弥散现象。该试验通过对3个（35、40、45）循环数的筛选，以40个循环数的扩增产物丰富、亮度高、清晰度好（图3）。

图3 不同循环次数的电泳结果

2.4 退火温度对小菜蛾ISSR－PCR体系的影响

PCR反应中，退火温度对扩增产物的影响较大，较低的退火温度允许适当错配，扩大了引物在基因组中配对的随机性，而较高的退火温度虽可提高配对专一性，却影响引物与模板的结合程度（图4）。

图4 温度梯度PCR结果

根据正交试验结果结合Tm值进行温度梯度PCR，从100个ISSR引物中进行引物筛选，试验所确定的17条引物的最适退火温度见表3。

表3 引物序列及最适退火温度1）

3 小结与讨论

本研究发现 Mg2＋浓度、模板DNA用量以及dNTPs浓度对小菜蛾ISSR－PCR扩增效果有显著影响。Mg2＋是Taq酶的激活剂，其浓度影响Taq酶的活性并且影响引物与模板的结合效率。低浓度Mg2＋使Taq酶活性降低，扩增效率低甚至无扩增产物［16］。而高浓度 Mg2＋容易发生PCR错配产生非特异性扩增，造成背景弥散，试验确定Mg2＋的最优浓度为1.5mmol／L。模板DNA用量影响引物与模板的结合几率，直接影响扩增产量，试验确定最优模板DNA用量为20ng。本研究发现，模板DNA浓度是影响小菜蛾ISSR－PCR反应的关键因素之一，其纯度也很重要，当模板DNA中含有少量RNA对ISSR扩增无明显影响，但是当模板DNA中残留较多的蛋白质，异丙醇，乙醇等杂质时往往会产生弥散，影响扩增效果，这与贺佳等［17］的研究结果一致。在反应体系中，dNTPs分子的磷酸基团能定量的与Mg2＋结合，高浓度的dNTPs会造成Mg2＋的拮抗作用，使实际反应中的Mg2＋浓度下降［18］，经过优化得到dNTPs最适浓度为0.2mmol／L。

此外，ISSR－PCR还受到退火温度，循环次数的影响。退火温度过低，扩增特异性差，杂带较多，背景深，不利于统计结果；随温度升高，特异性增强，但退火温度过高影响引物与模板DNA的结合，电泳条带弱，甚至没有扩增［19］。本研究根据引物Tm 值，进行Tm±8℃温度梯度筛选，确定了17条引物的退火温度（见表3）。试验表明：不同引物的最适退火温度不同，不能以单一的退火温度进行所有引物的试验［20］，同一引物对于不同的物种，退火温度可能不同。循环次数决定扩增程度，循环次数过多增加非特异性扩增产物的数量和复杂性［21］，通过不同循环次数的对比，确定小菜蛾ISSR－PCR反应以40个循环最佳。

本文采用正交试验设计方法，以小菜蛾基因组DNA为模板DNA，筛选出小菜蛾ISSR－PCR的最优反应体系（20μL）为：Mg2＋浓度1.5mmol／L、Taq DNA聚合酶2.5U、dNTPs浓度0.2mmol／L、引物浓度1.25μmol／L、模板DNA量20ng。与单、双因素设计相比，兼顾了各因素之间的互作，减少了处理组合，大大节约了时间，降低了试验成本。为小菜蛾遗传多样性分析等提供了重要支持。

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