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胶红酵母固定化方法研究

2012-09-28于梅艳

中州大学学报 2012年3期
关键词:缓冲溶液通透性海藻

于梅艳

(中州大学化工食品学院,郑州450044)

胶红酵母固定化方法研究

于梅艳

(中州大学化工食品学院,郑州450044)

研究胶红酵母固定化方法,并测定所得固定化细胞的机械强度和通透性,对固定化方法进行初步筛选;研究磷酸缓冲溶液对固定化细胞强度的影响,最终得到目的固定化方法。试验表明:CA-活性炭(C)复合凝胶包埋所得固定化细胞,经0.6%聚乙烯亚胺(PEI)强化12 h,再经1%的戊二醛强化3 h后,机械强度大大提高,能耐磷酸缓冲液。

胶红酵母;细胞固定化;机械强度;通透性

本文主要采用海藻酸钙、海藻酸铝、明胶、卡拉胶、聚乙烯醇、活性炭等载体固定化胶红酵母,选择合适的细胞固定化方法,以得到机械强度高、细胞通透性好且酶活保留率高的固定化细胞,最终用于生物转化技术。

1.材料和方法

1.1 酵母菌株

胶红酵母由郑州大学新药研发中心筛选。

1.2 材料

1.2.1 培养基

蛋白胨为0.2%,玉米浆为2%,甘油为3%。

1.2.2 原料及试剂

玉米浆由安阳第一制药厂提供。琼脂粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、戊二醛、海藻酸钠及其他试剂均为分析纯。颗粒状活性炭、聚乙烯亚胺为工业级。明胶、卡拉胶为食品级。磷酸缓冲溶液自制,转化底物自制。

1.3 试验方法

1.3.1 培养细胞

接种量为1环/20 mL,放入摇床,生长温度为32℃,摇床转速为210 r/min,培养40 h。

1.3.2 固定化方法

细胞固定化按文献[1-4]方法进行。

a.海藻酸钠包埋法

用生理盐水配制一定浓度的海藻酸钠(CA)溶液20 mL,煮沸使其充分溶解,冷却至48℃备用;取适量湿菌体加入生理盐水调制成均匀的菌悬液;将菌悬液与海藻酸钠溶液混合,并充分摇匀;将20 mL 0.05 mol/L氯化钙溶液移入一个无菌三角瓶中;将海藻酸钠菌体混悬液移入无菌注射器中,适度加力,将其滴入0.05 mol/L的氯化钙溶液中;滴完后倾去溶液,加入适量无菌去离子水冲洗1次;重新加入适量0.05 mol/L氯化钙溶液4℃平衡过夜。

b.海藻酸铝包埋法

只需把方法a中氯化钙换为氯化铝即可。

c.明胶-戊二醛复合法

将明胶配制成浓度为6%的生理盐水溶液,煮沸溶解,冷却至48℃左右,与生理盐水调制的菌体悬浮液在不高于45℃的条件下混合均匀,加入1%戊二醛交联凝固,置于4℃以下的冰箱中4 h左右,取出切块后浸泡于0.5%戊二醛中于4℃下硬化一段时间,将固定化细胞滤出、水洗后备用。

d.卡拉胶包埋法

在4.5 g卡拉胶中加入150 mL生理盐水,沸水浴溶解后于50℃水浴;取25 g酵母菌体,加入75 mL生理盐水,搅拌均匀后升温至40℃,加入3 mL甲苯,立即与卡拉胶溶液混合,倒入浅盘中冷却,加2.25%KCl,硬化 3 h,倾去 KCl,洗涤,切成 5 mm 小块冰箱保存备用。

e.卡拉胶-明胶复合包埋法

卡拉胶的浓度设定为3%,明胶的浓度作以下几个平衡:3%、4%、5%、6%,将以上两种包埋剂充分溶解并混匀,其他方法同d,得到5 mm见方小块于冰箱中保存备用。

f.聚乙烯醇(PVA)-海藻酸钠-活性炭(C)复合凝胶包埋法

PVA 10 g,适量(2% -4%)海藻酸钠,蒸馏水100 mL,适量(0-2%)活性炭,加热煮沸,PVA冷却到室温;硼砂3 g,氯化钙4 g,各加水50 mL,分开溶化后,混合,充分搅拌成胶状;将收集的一定量的菌体加入到PVA中搅拌均匀。将混有菌体的PVA用注射器匀速滴入硼砂和氯化钙混合液中,充分反应后,滤出,洗净,即得4 mm左右均匀小珠。

1.3.3 机械强度测定方法

a.砝码加压法[5]

取几个大小均匀的颗粒,上面加盖一个载玻片,在其上加压砝码至压扁不碎,平均每个颗粒的砝码克数记为颗粒的机械强度。

b.振荡法

取一定量的固定化细胞,在磷酸缓冲溶液中,于150 r/min上摇床震荡,定时观察其颗粒的变化。

1.3.4 固定化细胞耐磷酸缓冲溶液性的测定

在磷酸缓冲溶液中加入一定量的包埋颗粒静置过夜,观察颗粒的变化情况;上摇床培养再观察颗粒的变化情况。

1.3.5 固定化细胞通透性测定方法

利用固定化细胞的生物转化的速率来判定。转化率为50%左右所需时间来表示,时间越少表示细胞通透性越好。

2.结果与讨论

2.1 海藻酸钠与氯化钙浓度的影响

钙离子是决定固定化细胞机械强度的重要因素,随着钙离子浓度的增加,固定化酵母的强度增加,较低的海藻酸钠浓度使凝胶相对渗透性能好,有利于底物进入和产物排出。本试验用海藻酸钠固定化红酵母细胞,海藻酸钠的浓度分别为2%、4%、6%,氯化钙溶液的浓度分别为2%、3%、4%。

从表1的结果可以看出选择较低的海藻酸钠浓度(4%左右)和较高的氯化钙浓度(4%左右)形成的凝胶固定化效果较好,机械强度高,转化底物时转化率到达50%所需时间较短。

表1 藻酸钠与氯化钙浓度对固定化细胞的影响

2.2 固定化材料的选择

2.2.1 各种方法固定化细胞的强度测定

a.耐压性能测试

各取若干粒不同方法固定化的细胞,平放于玻璃板上,用纸覆盖,逐渐增加砝码的重量,并观察细胞颗粒受压后的完整情况,以不引起颗粒破碎而使用的最大砝码重量来衡量细胞颗粒的机械强度,表2可以看出10%PVA-4%CA的耐压性能最好,为120 g/粒。

表2 不同固定化细胞的耐压性能

b.耐振荡性能测试

各取若干粒不同方法固定化的细胞,置于pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中,而后上摇床振荡,摇床转速为150 r/min,观察它的耐振荡性能。从表3可以看出用卡拉胶、明胶和卡拉胶-明胶固定化的细胞均在0.5 h左右完全破碎,呈糊状,但用CA、PVA-CA和PVA-CA-C固定化的细胞1 h左右颗粒才出现破裂且没有完全破碎,这说明PVA-CA,PVA-CA-C复合凝胶固定化的细胞耐振荡性能稍好,但也不能耐磷酸缓冲液,在磷酸缓冲液中浸泡一会几乎就不呈颗粒。

表3 不同固定化细胞的耐振荡性能

2.3 活性炭用量的影响

活性碳的用量对固定化细胞的通透性有一定影响,用CA-C-PVA包埋固定化细胞,活性炭的浓度为0、0.5%、1%、2%,测定转化率为50%时的转化时间,及其颗粒的耐压性能,结果见表4。50%所需时间。

表4 活性炭对包埋颗粒通透性和机械强度的影响

由表4可知加活性炭的反应速率明显高于不加活性炭的包埋颗粒,但随着活性炭的增加颗粒的机械强度逐步减小,故活性炭的用量也不能太多,选择0.5%。

2.4 .固定化细胞对磷酸缓冲溶液耐受性研究

据文献[4]报道,用聚乙烯亚胺溶液来处理海藻酸钙凝胶,分别考察了聚乙烯亚胺-戊二醛交联强化法来提高凝胶颗粒抗磷酸盐的能力,发现经强化的固定化细胞的抗磷酸盐能力、机械强度均得到了提高,并且酶活力没有变化,操作稳定性较好。

本试验分别用4%CA、4%CA-0.5%C和4%CA-10%PVA-0.5%C固定化红酵母细胞,再经0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% 聚乙烯亚胺处理12 h,再用1%的戊二醛浸泡强化3 h,而后测其机械强度和转化效果。试验结果见表5和图1。

固定化细胞的机械强度直接影响着其使用寿命,机械强度越大,在进行生物转化过程中越耐磨,其使用寿命越长。表5的结果表明,经PEI强化的固定化细胞,其机械强度有了明显提高,其中PEI对4%CA-0.5%C固定化细胞强度作用最明显,经1%PEI强化后,其机械强度竟达到260.1g/粒,是未强化时的14.2倍。

表5 不同浓度PEI强化固定化细胞的机械强度

图1的结果表明,PEI浓度对固定化细胞通透性有影响,随着PEI浓度的增大,固定化细胞的通透性有明显降低,但0.6%PEI强化4% -0.5%C固定化细胞的通透性较好,转化效果与游离细胞相当,在磷酸缓冲溶液中进行生物转化后,其固定化细胞颗粒完好无损,经反复试验,颗粒仍完好,可反复使用。

图1 PEI浓度对不同固定化细胞通透性的影响

3.结论

本文对细胞固定化方法进行研究,用海藻酸钙(CA)、海藻酸铝、明胶、卡拉胶、卡拉-明胶、聚乙烯醇(PVA)-CA和聚乙烯醇-活性炭-CA复合凝胶分别对酵母细胞进行固定化,并通过测定各种方法所得固定化细胞的机械强度和通透性,对固定化方法进行初步筛选;研究磷酸缓冲溶液对固定化细胞强度的影响,最终得到4%CA-0.5%C-0.6%PEI-1%戊二醛固定化细胞机械强度好,通透性好,并且耐磷酸缓冲溶液,可以反复使用,此法固定化的细胞有望实现生物制药的工业化。

[1]华蕾,汤一新,孙志浩,等.固定化细胞拆分DL-泛解酸内酯的初步研究[J].工业微生物,2001,31(4):5-8.

[2]孙志浩,吴燕,王蕾,等.固定化酵母细胞生产1,6-二磷酸果糖研究[J].工业微生物,1996,26(2):7-12.

[3]党建章,郑雄敏,李飞.PVA包埋产延胡索酸酶的黄色短杆菌的固定化研究[J].南昌大学学报:理科版,1995,19(4):380-384.

[4]杨雪蕊,孙达远,罗艺,等.聚乙烯亚胺对海藻酸固定化酵母细胞的强化作用[J].海南大学学报:自然科学版,1999,17(1):47 -49.

[5]陈九武,赵学慧,吴思方.固定化细胞合成酯类载体的研究[J].工业微生物,1997,27(3):27-31.

(责任编辑 吕志远)

Abstract:The immobilization methods were studied in this paper.The immobilization methods were primarily screened by evaluating the mechanical intension and permeability of immobilized cell granules.The influence on buffer of immobilized cells was studied later and the optimum immobilized method was selected.The batch experiment results indicated that the immobilized cell granules obtained by active carbon-CA complex treated and intensified by 0.6%polyethylene imine and 1%Glutaraldehyde had the best mechanical intension,permeability and endurance on phosphate buffer solution.

Key words:Rhodotorula mucilaginosa;immobilized cell;mechanical intension;permeability

Study on the Immobilization Methods of Rhodotorula Mucilaginosa

YU Mei-yan
(College of Chemical and Food Engineering,Zhongzhou University,Zhengzhou 450044,China)

TQ92

A

1008-3715(2012)03-0123-03

2012-03-01

于梅艳(1980—),女,河南周口人,硕士,中州大学化工食品学院助教,研究方向:固定化细胞技术及其应用。

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