牛轮状病毒RT－LAMP检测方法的建立

李 巍，李 宁，袁万哲，孙继国

（河北农业大学动物科技学院，河北保定071000）

牛轮状病毒（Bovine rotavirus，BRV）属于呼肠病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus）成员，该病毒由美国 Mebus C A等［1］首次分离鉴定，并证明了其对犊牛的致病性。已知牛轮状病毒是犊牛非细菌性腹泻的主要病原之一［2］，可引起1日龄～7日龄犊牛的精神沉郁、食欲废绝、水样腹泻、严重脱水和酸中毒等临床症状，感染犊牛常常发生死亡，病死率高达50%。据报道加拿大魁北克地区腹泻犊牛中轮状病毒的检出率高达74.3%［3］，英国犊牛轮状病毒腹泻的发病率为60%～80%，病死率为0%～50%［4］，我国也有犊牛感染轮状病毒的报道。该病自报道以来，已在全世界主要养牛国家和地区普遍发生和流行，给养牛业造成相当严重的经济损失。

环介导等温扩增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是由 Notomi T等［5］建立的一种新型核酸扩增技术，其原理是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，利用链置换DNA聚合酶，在等温条件下进行自动循环的链置换核酸扩增反应，其产物鉴定可直接通过白色沉淀或荧光来进行判断［6］。该技术具有特异性高、操作简便、反应迅速、成本低廉等优点，目前在一些病原微生物的检测中开始被广泛应用［7－8］。本研究根据LAMP反应原理，优化相关反应条件，建立了牛轮状病毒的反转录－环介导等温扩增（RT－LAMP）快速检测方法，为牛轮状病毒的基层检测和该病防控奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、病料与细胞 牛轮状病毒（BRV）、沙门菌、猪圆环病毒2型（PCV－2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）均河北农业大学动物科技学院传染病实验室分离保存，牛病毒性腹泻病毒（BVDV）为中国兽监察所保存；腹泻犊牛粪便采集于当地牛场。Marc－145细胞由河北农业大学动物科技学院传染病实验室保存。

1.1.2 主要试剂 SYBR GreenⅠ为Solarbio公司产品；d NTPs、Taq DNA聚合酶为天根生化科技（北京）有限公司生产；MgCl2为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；Bst DNA聚合酶为NEB公司产品；RNA酶抑制剂、反转录酶、TransZol均为北京全式金生物科技公司产品，DMEM为Gibcobrl公司产品。

1.1.3 引物的设计与合成 根据登录于GenBank的BRV VP7基因序列（GU984762.1），应用 DNA Star进行序列比对后利用Primer premier 5进行普通PCR扩增引物设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为：

VP7S：5′－GTATGGTATTGAATATACCAC－3′；VP7A：5′－GATCCTGTTGGCCATCC－3′。

根据登录于GenBank的BRV VP7基因序列，应用DNA Star进行序列比对后利用Primer ex－plorer V4进行外引物和内引物的设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为：

F3：5′－GCACCATACGCAACTGTA－3′；B3：5′－TGATTGACGTAATCCACTACC－3′；FIP（F1c＋F2）：5′－GTCTAAAACATTTGCGCCGC－AAGTTAGGACCAAGGGAGA－3′；BIP（B1c＋B2）：5′－TCACAGCTGATCCAACAACTACACGT GTAAAACACTTGCCACC－3′。其中 F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物。

1.2 方法

1.2.1 病料的处理及接种 将犊牛腹泻粪便样品用p H7.4的 PBS稀释成200 g／L 的悬液，3 000 r／min离心 20 min，取上清，加入双抗 （10 000 U／mL），将病料与50μg／mL的胰酶按1∶1混合，37℃处理1 h，接种于生长良好的Marc145单层细胞，37℃吸附1 h，其间每15 min摇匀1次，加入维持液，在37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养观察，48 h～72 h为一个传代周期。传代前培养物冻融3次，与50μg／mL胰酶按1∶1混合，进行盲传，待细胞出现 病变（CPE）达70%收毒。

1.2.2 BRV核酸的提取 按Trizol法提取病毒RNA。取病毒液250μL，加入750μL TransZol，剧烈震荡，室温放置5 min；加入250μL氯仿，剧烈震荡后室温放置10 min，4℃下12 000 r／min离心15 min；取上清550μL转入到另一1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇颠倒混匀，室温沉淀15 min，4℃下12 000 r／min离心20 min；弃上清液，用750 mL／L的乙醇溶液800μL洗涤沉淀，干燥10 min～20 min后用10μL溶解液溶解RNA沉淀，溶解后于－20℃保存备用。

1.2.3 RT－LAMP反应体系的优化

1.2.3.1 RT－LAMP反应组分的优化 根据反应体系优化的策略［9］，对反应组分中 Mg2＋浓度、d NTPs浓度、Bst DNA聚合酶浓度、引物浓度进行优化。其他成分：反转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂0.5μL，模板2.0μL最后用水补至25μL。

试验中将 MgCl2（25 mmol／L）的量以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μL依次递增；将d NTPs（2.5 mmol／L）的量以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL依次递增；将Bst DNA聚合酶 （8 U／μL）以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL依次递增；在引物初浓度均为10μmol／L条件下，研究了RT－LAMP反应的引物间比例，依次按照以下比例加入外引物与内引物：0∶1，1∶0，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，选择最佳浓度比。从多次重复试验中确定各组分最佳用量。

1.2.3.2 RT－LAMP的可视性观察 将反应产物中加入1μL SYBR GreenⅠ，1 min～5 min后观察结果，阳性呈绿色，阴性保持原有颜色。

1.2.3.3 RT－LAMP反应体系中反应温度的优化因为本研究所涉及的序列AT含量较为丰富，所以根据引物Tm值的变化范围，将温度按58、59、60、61、62、63、64℃依次递增，从多次重复试验中确定最佳反应温度。分别取其4μL反应产物上样于20 g／L琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.3.4 RT－LAMP反应体系中反应时间的优化为了检测反应时间对RT－LAMP试验的影响，将反应时间依次按照10、20、30、40、50、60 min进行扩增，分别取其4μL反应产物上样于20 g／L琼脂糖凝胶电泳，选择可完成RT－LAMP反应的最佳时间。

1.2.4 RT－LAMP的特异性检测 在优化后的条件下，分别以沙门菌、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪圆环病毒2型（PCV－2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为模板，以细胞营养液为阴性对照，同时进行RT－LAMP反应，分别取4μL反应产物用20 g／L琼脂糖凝胶进行电泳分析，观察结果。

1.2.5 RT－LAMP与 RT－PCR灵敏度的对比检测测得体外转录的RNA浓度为6.52 mg／L，将其进行倍比稀释，其浓度依次为6.52×10－1mg／L～6.52×10－16mg／L。用所建立的RT－LAMP检测方法分别对其进行扩增，同时用RT－PCR方法进行扩增，取4μL反应产物上样于20 g／L琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.6 阳性样品的检测 将6个阳性粪样，1个阴性粪样样品和1个标准阳性样品（BRV的细胞培养液）分别经过处理提取核酸后作为模板，用优化条件后的RT－LAMP进行检测，反应产物用20 g／L琼脂糖凝胶进行电泳分析，观察结果。

2 结果

2.1 RT－LAMP反应体系的优化

2.1.1 RT－LAMP反应组分的优化 优化后的反应组分体系见表1，优化后反应结果的琼脂糖凝胶电泳见图1，可视化结果见图2。

2.1.2 RT－LAMP反应体系中温度的优化 通过对温度的优化，发现此方法进行RT－LAMP扩增反应的最适温度为62℃。在此温度下，电泳条带清晰明亮（图3）。

2.1.3 RT－LAMP反应体系中时间的优化 通过对时间的优化，发现此体系只需要20 min就能得到较淡的条带，50 min可以得到十分清晰的反应条带（图4）。

表1 RT－LAMP优化后的反应体系Table1 Reaction system of RT－LAMP after optimization

2.2 RT－LAMP的特异性试验

本研究用沙门菌、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪圆环病毒2型（PCV－2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为对照，以细胞营养液为阴性对照，在相同的优化条件下同时进行RT－LAMP扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测表明，只有以BRV为模板才能扩增出清晰的梯形条带，说明该方法特异性较好（图5）。

2.3 RT－LAMP与RT－PCR的灵敏性试验

从细胞培养液中提取的RNA进行连续10倍稀释，分别用RT－PCR和RT－LAMP进行灵敏性试验。细胞培养液中提出的总DNA质量浓度为6.52 mg／L，随着RNA浓度的降低，目的条带亮度逐渐变淡（图6～图），RT－LAMP能检测出的最低RNA浓度为6.52×10－8mg／L，RT－PCR能检测到6.52×10－6mg／L。结果表明，RT－LAMP 比 RT－PCR的灵敏度高100倍。

2.4 阳性样品的检测

使用已建立的方法，对PCR检测呈阳性的6个阳性样品进行扩增，结果都可扩增出清晰的梯形条带。表明建立的RT－LAMP方法可以用于对BRV病料的检测（图8）。

3 讨论

轮状病毒是导致人和各种幼畜病毒性腹泻的重要病原体［10］。犊牛的轮状病毒感染十分普遍，给养殖业造成了巨大的经济损失。同时，该病又与其他细菌和病毒引起的腹泻性疾病在临床上难以鉴别，所以准确的诊断对科学防控本病具有重要意义。目前实验室检测BRV的方法有血清学抗体检测、电镜观察、ELISA、核酸探针、RT－PCR等。但是电镜观察、核酸探针的成本较高而且需要昂贵的仪器，因此不适合大规模使用；血清学抗体检测、ELISA常常受到交叉反应的影响而呈现假阳性结果；RT－PCR很有效但是耗时较长，无法做到简便快捷；Real－time PCR从灵敏度、特异性与速度上都具有一定优势，但是检测成本较高。

LAMP是日本的Notomi T等在2000年创建的检测核酸新的技术。其原理是分别针对靶序列中6个基因区段设计2对特异引物，在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应，一步完成RNA的检测。该技术因其特异性强，扩增效率高，反应灵敏，操作简单，结果肉眼可见而被国内外学者应用到多种细菌及病毒的基因检测中，如马轮状病毒（ERV）、丙型肝炎病毒（HCV）、禽流感病毒（AIV）等。但目前很少见到使用该技术检测BRV的报道。本研究所建立的RT－LAMP方法检测临床样本中BRV的结果表明，该方法具有灵敏度高，特异性强，检测程序简单快捷，不需要特殊仪器等优点，有望成为适合临床应用的新方法。

本研究选取BRV VP7的保守序列，应用Primer explorer V4设计了针对该序列保守区域的外引物和内引物，通过对反应体系、反应时间、灵敏度、特异性的优化，建立了一种针对BRV的RT－LAMP快速检测方法。该方法能特异的检测BRV，并且表现较高的灵敏度，是常规RT－PCR的100倍。其灵敏度与Imai M等［11］建立的针对H5亚型的高致病性 AIV的 RT－LAMP检测方法和 Chen H T等［12］针对PRRSV建立的RT－LAMP检测方法的灵敏度相当。而且整个反应只需要在水浴锅中50 min即可完成，真正实现了无需贵重仪器的检测。并且，通过加入荧光染料SYBR Green I，实现了 RT－LAMP技术的可视性。同时，本研究过程表明，RT－LAMP检测技术无需单独的逆转录，只需一步即可完成对靶序列的扩增，没有核酸的变性复性过程；在等温条件下进行扩增，不仅节省时间和成本，更重要的是减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会。如果将该方法进一步优化和完善，实现多重检测，将会在犊牛腹泻的早期诊断及预防控制方面发挥重要作用。

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