叉尾斗鱼遗传多样性的RAPD分析

刘宏毅，黎明星、，肖俊、，黄愉淋、，张明，甘西

叉尾斗鱼Macropodusopercularis隶属于鲈形目Perciformes、斗鱼科Belontiidae、斗鱼属Macropodus，是一种广泛分布于中国南方地区的小型淡水鱼类[1]。1868年Carbonier从中国将叉尾斗鱼引入法国，因其体形美观，色彩艳丽，故而将其驯化为著名的热带观赏鱼种，并得名“天堂鱼”。随后叉尾斗鱼作为观赏鱼类，在日本、南美洲以及西欧等地广为流传。中国南方地区是叉尾斗鱼的主要产地，有着丰富的种质资源，但因环境破坏等因素的影响，野生叉尾斗鱼数量正在不断减少。为了合理保护和利用叉尾斗鱼资源，可以采用先进的分子标记技术对其遗传结构进行研究，开展选育工作，培育出更能迎合市场需要的新品种。

随机扩增多态DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术具有快速、简便、敏感、产率高等特点，目前已在品种品系遗传多样性分析、物种亲缘关系和进化关系分析等多方面得到广泛应用[2]。一些学者采用RAPD分子标记技术对鱼类的遗传多样性及群体间的遗传差异进行了研究[3-10]。本试验中，作者采用RAPD技术对叉尾斗鱼5个群体的遗传多样性进行分析，旨在初步了解叉尾斗鱼种质资源的状况，并为该鱼的资源保护和开发提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集 叉尾斗鱼样本于2009年7月至10月分别采自广西南宁心圩镇(15尾)、桂林七星公园风景区(15尾)、福建龙岩新罗区雁石镇厦老村(10尾)、福州闽侯上街镇(15尾)及广州萝岗开发区华峰寺(15尾)的天然水域，分别称为南宁群体(NN)、桂林群体(GL)、龙岩群体(LY)、福州群体(FZ)和广州群体(GZ)，体长为4.9～7.4 cm，采回后暂养在5个水族箱内备用。

1.1.2 主要试剂 基因组DNA提取试剂盒、Taq聚合酶、dNTP购自天根生化科技(北京)有限公司，40条10 bp随机引物购自北京三博远志生物技术有限责任公司，DSTM2000 Marker购自广州东盛生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 PCR仪(Biometra TGRADIENT)，离心机(Sigma 1-14)，凝胶成像系统(Gene Genius)。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的制备 剪取新鲜叉尾斗鱼的背部肌肉，按基因组DNA提取试剂盒操作步骤，进行总DNA的提取(确保DNA质量)。对提取的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外分光光度计测定其浓度。

1.2.2 引物筛选和RAPD扩增 以基因组DNA为模板，按下列体系和程序进行引物筛选和RAPD扩增。反应总体积为25 μL，包括10×buffer(含15 mmol/L MgCl2)2.5 μL、模板DNA(50 ng/μL)1.5 μL、引物(10 μmol/L)1.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL、Taq酶(2.5 U/μL)0.25 μL，用ddH2O补至25 μL。

扩增反应程序为：94 ℃下预变性4 min；94 ℃下变性45 s，36 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸1 min，共进行36个循环；最后于72 ℃下再延伸7 min。反应结束后于4 ℃下保存备用。取扩增产物5 μL，在15 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳分离(1×TAE，90 V，约1 h)，用E.B.染色，然后在紫外灯下观察并拍照。

1.2.3 RAPD数据处理 根据RAPD-PCR的产物电泳图谱进行分析，在电泳条带中相同的迁移位置，将DNA片段的有和无分别记为1和0，仅记录清晰且重复性好的条带，所有数据统计后形成矩阵[11]。将相同迁移距离的条带看作1个片段，统计片段总数及多态片段数，计算多态位点比例(P)：

P=多态位点数/总位点数×100%。

采用软件PopGene 32计算Shannon指数和Nei基因多样性指数，并进一步获得遗传相似性指数和遗传距离[11]。

2 结果与分析

2.1 RAPD的扩增结果

从40条引物中筛选出扩增效果良好的11条引物用于群体的遗传变异试验(表1)。对叉尾斗鱼5个地理群体共扩增出139条片段，各群体扩增得到DNA片段数为87～105，每条引物扩增的片段数为8～16，平均为10.73。图1为用引物W1009602对叉尾斗鱼5个群体部分个体扩增结果的电泳图谱。

注：1～4为南宁群体；5～8为桂林群体；9～12为龙岩群体；13～16为福州群体；17～20为广州群体；M为DS 2000。Note:1-4 NN population; 5-8 GL population; 9-12 LY population; 13-16 FZ population; 17-20 GZ population; M DS 2000.图1 用引物W1009602对叉尾斗鱼5个群体部分个体的扩增结果Fig.1 The amplification of individuals in 5 populations of paradisefish by the primer W1009602

编号No.引物序列primer sequences扩增条带数bandsW1009570CGCCATAGCC14W1009572CCGCCCAAAC16W1009573TTCCCGTGCC15W1009582CCATCGGAGG16W1009590AGTCGGCCCA16W1009592ACCACCCGCT16W1009593AGTCCCCCTC9W1009598GAAACGGGTG11W1009600GTGATCGCAG8W1009602AGCCGACGAA8W1009603GACCGCTTGT10

2.2 遗传多样性

对叉尾斗鱼5个地理群体的相关遗传参数统计结果见表2。叉尾斗鱼5个群体的Nei基因多样性指数为0.1042～0.1457,Shannon指数为0.1543～0.2176。

2.3 遗传相似性系数和遗传距离

根据11个有效引物进行PCR扩增的结果转化成0、1矩阵，再将数据输入到Popgene 32软件中，计算出叉尾斗鱼5个群体间的遗传相似性系数和遗传距离，结果见表3。遗传相似性系数是衡量种质资源变异水平的一项重要指标，相似性系数越大，两个群体间的亲缘关系越近，反之，亲缘关系越远。由表3可见，各群体间的相似性系数为0.5769～0.7831，其中福州群体与龙岩群体的亲缘关系最远，而广州群体与桂林群体的关系最近。

表2 叉尾斗鱼5个群体的RAPD片段数和遗传多样性指数

表3 叉尾斗鱼5个群体的遗传相似性系数和遗传距离

注：对角线以上的数据为遗传相似系数；对角线以下的数据为遗传距离。

Note:The data above diagonal line are genetic similarity and the data below diagonal line genetic distance.

2.4 聚类分析

通过PopGene 32软件对RAPD数据进行处理，采用UPGMA做聚类分析，其聚类结果可以初步反映出各群体间的亲缘关系，结果见图2。

图2 叉尾斗鱼5个群体的聚类分析图Fig.2 RAPD cluster analysis of five popolations of paradisefish M.opercularis

3 讨论

3.1 不同地理群体叉尾斗鱼的遗传多样性

叉尾斗鱼5个群体中共检测到139个位点，其中多态位点为118个，多态位点比例为84.89%。各群体内部的多态位点比例为26.44%～40.95 %，Shannon指数为0.1543～0.2176，Nei基因多样性指数为0.1042～0.1457；而总群体的Shannon指数高达0.4606，Nei基因多样性指数高达0.3110。本研究结果表明，叉尾斗鱼群体内的多样性较低，其遗传差异主要来自群体间。这与何燕林等[12]对圆尾斗鱼以及王培欣等[8]对叉尾斗鱼不同地理群体的RAPD研究结果相似。

叉尾斗鱼属于湿地动物，各地理群体间缺乏重大隔离，其亲缘地理学可能与河流物种有所不同[13]。叉尾斗鱼分布广泛，属连续分布物种，但由于人为干扰、环境破坏，叉尾斗鱼的生境正不断缩小、支离破碎，这些破碎的生境宛如被海洋隔离的一座座孤岛，各地理群体间缺乏基因交流，同时为了适应当地的生活环境，各地理群体独立进化，因此，造成了叉尾斗鱼群体间遗传差异较大[14]。而各群体内部遗传多样性水平较低的原因，可能是由于叉尾斗鱼生境易受破坏，极易造成其数量波动，又因叉尾斗鱼具有较强的繁殖能力，其种群数量特征常表现为先急剧减少，后又增加[15-16]。因此，结合本试验结果推测，这5个叉尾斗鱼群体都曾遭受不同程度的“瓶颈效应”的打击，其中以福州、龙岩两个群体所经历的瓶颈最为严重。

3.2 叉尾斗鱼的开发利用

叉尾斗鱼作为世界上最早的热带观赏鱼品种，享有“天堂鱼”的美誉。在西方国家，叉尾斗鱼是最受欢迎的观赏鱼种之一。

据统计，全球观赏鱼类年贸易总额高达50亿美元，并以年均10%以上的速度增长，全球观赏鱼产业表现出迅猛发展的态势[17]。一直以来，中国将观赏鱼养殖业看成是副业，过分强调食用鱼养殖产业在渔业经济中的支柱地位，致使观赏鱼产业停滞不前，养殖技术落后，产量极不稳定。近年来，随着中国人民生活水平的不断提高，中国对观赏鱼的需求量也在日益增长，观赏鱼产业正蓬勃发展。目前，市场上常见的观赏鱼类除金鱼外，绝大多数都是外来物种，而中国本土观赏鱼类资源却没有得到很好的开发和利用，特别是叉尾斗鱼[18]。中国南方地区是叉尾斗鱼的主要产地，有着良好的种质资源。本研究结果表明，叉尾斗鱼群体间遗传多样性丰富，有较大的选育潜力。因此，可以采用先进的遗传育种技术对叉尾斗鱼进行选育，以便选育出更好的新品种，不断满足观赏鱼市场的需求，走一条经济生产与物种保护相结合的可持续发展道路。

参考文献：

[1] 孟庆闻,苏锦祥,缪学祖.鱼类分类学[M].北京:中国农业出版社,1995:931-932.

[2] 林炜,刁丽娟.RAPD技术及其在动物遗传多样性分析中的应用[J].生物学通报,2002,37(3)：17-19.

[3] AlMomin S,Al-Enzi K,Al-Hussaini M,et al.Pampus Argenteus species polymorphism using RAPD-PCR[J].Journal of Biotechnology，2010,150:125.

[4] Liu Yun-guo,Chen Song-lin,Li Ba-fang.Genetic differentiation among common and selected hatchery populations of flounder: Evidence from RAPD markers[J].Biochemical Systematics and Ecology，2007(7):689-695.

[5] 张金洲,项智锋,谢红兵.加洲鲈与罗非鱼群体的RAPD分析[J].安徽农业科学,2010(1)：528-529.

[6] 陈友明,陈校辉,潘莹,等.江黄颡(♀)和乌苏里拟鲿(♂)及其杂交子代遗传变异的RAPD分析[J].上海海洋大学学报,2010，19(1):12-18.

[7] 张敏莹,刘凯,段金荣,等.长江下游铜鱼遗传多样性的随机扩增多态DNA(RAPD)分析[J].中国农学通报,2009,25(6):274-277.

[8] 王培欣,罗建仁,白俊杰,等.斗鱼属鱼类亲缘关系的Cyt b基因序列和RAPD分析[J].动物学杂志,2009,44(5):14-23.

[9] 季维智,宿兵.遗传多样性研究的原理与方法[M].杭州:浙江科学技术出版社,1996:132-134.

[10] 方展强, 陈军, 郑文彪，等.鳜野生群体与养殖群体的RAPD分析[J].大连水产学院学报，2005,20(1)：16-19.

[11] Yeh F,Yang R,Boyle T B J,et al.POPGENE, the user-friendly shareware for population genetic analysis[M]//Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Canada,1997.

[12] 何燕林,肖克宇,唐湘北,等.湖南圆尾斗鱼三个地理群体遗传多样性的RAPD 分析[J].湖南农业大学学报,2006,32(4):406-411.

[13] Tzeng C,Lin Y S,Lin S M,et al.The phylogeography and population demographics of selected freshwater fishes in Taiwan[J].Zoological Studies,2006，45(3):285-297.

[14] 周红章.物种与物种多样性[J].生物多样性,2000,8(2):215-226.

[15] 杨玉慧,李义明.分子生态学研究与动物多样性保护[J].生物多样性,2001,9(3):284-293.

[16] 赵凯,李俊兵,杨公社,等.青海湖及其相邻水系特有裸鲤属鱼类的分子系统发育[J].科学通报,2005,50(13):1348-1355.

[17] 牟希东,胡隐昌,汪学杰,等.中国外来观赏鱼的常见种类与影响探析[J].热带农业科学,2008,28(1):34-40.

[18] 赵玉宝,郭大民,王鸿媛.我国观赏鱼的发展现状和问题[J].科学养鱼,1999(2):1-2.