植物甾醇-共轭亚油酸酯对结肠癌细胞增殖的抑制作用

田 莉 莉, 王 际 辉, 叶 淑 红, 王 晗

( 大连工业大学 辽宁省食品生物技术重点实验室, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

近年来,大肠癌的发病率不断提高[1],该病在印度、南美、非洲等欠发达地区的发病率明显较低,这可能与饮食习惯有关。流行病学调查表明,低脂肪、低蛋白、高膳食纤维饮食可以降低大肠癌的发病率。

植物甾醇是一种存在于植物中的天然活性物质,具有抗肿瘤、抗病毒、防治前列腺疾病、消炎退热[2]的等多种生理功能。但是由于植物甾醇水溶性和脂溶性都很差,大大限制了其生理功能的发挥。因此对植物甾醇进行改性,提高其水溶性和脂溶性,进而扩大其应用范围和提高其生理功能一直是重要研究方向之一。共轭亚油酸是由亚油酸衍生的共轭双烯酸的多种位置和几何异构体的总称,具有防癌[3]、减肥[4]、增强免疫[5]等生理功能。但共轭亚油酸由于双键的存在,极易氧化,生理功能也因此受限。植物甾醇-共轭亚油酸酯(PCLA)与植物甾醇相比,其利用吸收率提高了约5倍；与共轭亚油酸相比,抗氧化性有所提高,应用范围和前景更加广泛,是一种新型药物。目前对植物甾醇酯抗肿瘤生物活性还未见文献报道,本实验就植物甾醇-共轭亚油酸酯对结肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用和可能的作用机制作了初步探讨。

1 实 验

1.1 原 料

植物甾醇-共轭亚油酸酯由大连工业大学提供,共轭亚油酸由大连医诺生物技术有限公司提供。用50%的DMSO溶解配制成200 mmol/L的储藏液,分装后置于-20 ℃备用；结肠癌细胞株HT-29由大连医科大学提供；RPMI1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS),Hyclone 公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)干粉,Sigma公司；TECAN SUNRISE酶标仪,Tecan Austia GmbH；MCO-17A CO2恒温培养箱,日本三洋电机株式会社；AE30/31倒置荧光显微镜,厦门Motic公司。

1.2 细胞培养

将结肠癌细胞HT-29置于含10%新生牛血清、青霉素(100 μg/mL)、链霉素(100 μg/mL)的RPMI 1640培养液中,于37 ℃、体积分数5%的CO2及饱和湿度培养箱中培养。

1.3 生长曲线测定

常规培养结肠癌HT-29细胞48 h,消化,用含10%的小牛血清、青霉素(100 μg/mL)、链霉素(100 μg/mL)的RPMI 1640培养液,调整细胞浓度为1×105个cell/well,接种于24孔板,每孔500 μL,每天每组3个重复孔,于37 ℃、5%CO2条件下培养7 d,每隔12 h吸去3个孔的培养液,消化、离心、重悬细胞,计算细胞数目。每个孔计数2次,得出细胞浓度的平均值,绘制生长曲线。

1.4 MTT法测定细胞增殖

将处于对数生长期的结肠癌HT-29细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,加入含10% FBS的RPMI 1640 培养液,吹打混匀后计数,离心,弃旧培养液,加入新的培养液,制成细胞悬液。调整细胞密度为1×105个/mL,接种于96孔培养板中,每孔100 μL,常规培养24 h,使细胞贴壁。将细胞培养液更换为含1%FBS的RPMI 1640培养液,每孔100 μL,培养6 h,使细胞同步化。细胞分为实验组(终浓度分别为50、100、150、200、250 μmol/L) 和空白组(直接加等体积的无血清且与实验组含有等量DMSO的RPMI 1640培养液),以上各组均设9个复孔,继续培养20、44、68 h,每个时间吸弃3个复孔中的液体,每孔加入0.5 mg/mL的MTT培养液(20 μL 0.5 mg/mL MTT,溶于80 μL无血清RPMI 1640培养液)100 μL,继续培养4 h,用PBS 清洗细胞表面1次,每孔加入150 μL DMSO,室温振荡混匀10 min,使结晶紫完全溶解,用酶标仪检测细胞570 nm处的吸光值,以空白组为对照组,其细胞活力为100%。其余各组计算细胞增殖抑制率:抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.5 细胞形态学观察

结肠癌HT-29细胞在不同浓度植物甾醇-共轭亚油酸酯培养液中培养48 h,用倒置荧光显微镜观察细胞形态。

1.6 统计学分析

2 结果与讨论

2.1 植物甾醇-共轭亚油酸酯对HT-29增殖的影响

用100～300 μmol/L植物甾醇-共轭亚油酸酯分别处理HT-29细胞24、48、72 h后,用MTT法研究细胞活力。结果由表1和图1可见,HT-29细胞活力与药物浓度及药物作用时间有很大关系。与对照组相比,植物甾醇-共轭亚油酸酯的浓度达到100 μmol/L对结肠癌HT-29细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.01),用100～300 μmol/L 植物甾醇-共轭亚油酸酯处理24 h后,细胞的存活率呈剂量依赖性下降趋势(P<0.05)；用植物甾醇-共轭亚油酸酯处理48或72 h后,细胞的存活率亦显著呈剂量依赖性下降趋势(P<0.05),在72 h植物甾醇-共轭亚油酸酯浓度为300 μmol/L时,细胞增殖抑制率达93.98%。

表1 植物甾醇-共轭亚油酸酯对HT-29细胞增殖的影响

图1 植物甾醇-共轭亚油酸酯对HT-29细胞活力的影响

Fig.1 Effect of PCLA on cell viability in HT-29 cells

2.2 植物甾醇-共轭亚油酸酯对HT-29细胞形态的影响

不同浓度植物甾醇-共轭亚油酸酯作用HT-29细胞24 h,倒置荧光显微镜观察结果如图2所示。图2中空白对照组HT-29细胞边缘清晰、胞质均匀,呈良好的贴壁生长状态。当植物甾醇-共轭亚油酸酯物质的量浓度为100 μmol/L时,HT-29细胞状态开始改变,随着剂量的增加,细胞状态逐渐变差,胞质混浊,体积缩小,折光性变差,圆形悬浮、脱落而死亡的细胞数量逐渐增大。从图2可以看出,植物甾醇-共轭亚油酸酯对HT-29细胞生长有明显地抑制作用,作用效果随浓度的增加而增强。

图2 植物甾醇-共轭亚油酸酯对细胞形态的影响(×200倍)

Fig.2 Effect of PCLA on morphocytology

3 结 论

采用MTT比色法检测不同浓度的植物甾醇-共轭亚油酸酯对体外培养结肠癌HT-29细胞增殖的影响。结果表明,植物甾醇-共轭亚油酸酯对结肠癌细胞HT-29 的生长和增殖有抑制作用,且以剂量-效应、时间-效应依赖的方式抑制增殖,使细胞增殖减缓,数目减少,体积变小。目前关于甾醇酯类抗肿瘤作用机制方面的研究还不够系统和深入,多数研究仍停留在药效观察水平,有待于进一步研究。

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