海参肠碱性磷酸酶的提取及粗酶的特性研究

程 菁 恒, 朱 蓓 薇, 吴 海 涛, 孙 进 健

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,EC 3.1.3.1,简称ALP)广泛存在于动物、植物与微生物中。在化学组成上,ALP为含锌的糖蛋白,是一类在碱性条件(pH 9～11)下具有高催化活性,能催化几乎所有磷酸单酯键生成无机正磷酸和对应醇、酚和糖等物质的一组水解酶类[1]。ALP作为动物代谢过程中重要的调控酶参与磷代谢活动,与海水中磷质和钙质的吸取、磷酸钙的生成、甲壳素的形成和分泌直接相关,且参与动物体内钙磷的代谢,维持适宜的钙磷比例,对动物的生存具有重要的意义[2]。

目前,从水产原料中提取碱性磷酸酶的研究报道很多,包括白鲢[3]、黄鳝[4]、泥鳅[5]、鲍鱼[6]、背角无齿蚌[7]、合浦珠母贝[8]、锯缘青蟹[9]、长牡蛎[10]、北极虾[11]、扇贝[12]等,但关于海参碱性磷酸酶的研究还未见报道。本论文以海参加工中的副产物——海参肠为原料,从中提取碱性磷酸酶,并通过研究最适温度及温度稳定性、最适pH及pH稳定性、金属离子和抑制剂对其的影响,初步探讨海参肠碱性磷酸酶的酶学性质,丰富海参的酶学理论。

1 材料与方法

1.1 原料与设备

新鲜海参肠,购自大连长兴水产市场；对硝基苯磷酸二钠盐(p-NPP),购于上海生工生物工程有限公司；牛血清蛋白为Fluka(Switzerland)产品,其他所用试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

UV-2100型分光光度计,UNIC(USA)；Z323K型冷冻离心机,HERMIE(GERMANY)；JJ 200Y型精密电子天平,美国双杰兄弟(集团)有限公司；8050型超滤装置,Millipore corporation,Bedford,M； YC-1型层析实验冷柜,北京博医康实验仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅,江苏金坛荣华仪器制造有限公司；pHS-3型精密pH计,上海雷磁仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 海参肠ALP的提取

海参肠经清洗后,称取200 g,加入600 mL预冷的含0.2% Triton X-100的Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L,pH 8.9)打浆。匀浆液于4 ℃浸提8 h,在13 500 r/min下冷冻离心15 min,收集上清液。按1∶4的体积比向上清液中加入经预冷的正丁醇,4 ℃搅拌过夜以脱脂释放膜蛋白,在13 500 r/min下冷冻离心15 min,收集上清液。在4 ℃下,缓慢加入硫酸铵使其饱和度达到70%(每100 mL上清液中加入43.6 g硫酸铵),盐析6～8 h。经13 500 r/min冷冻离心15 min后,收集沉淀。沉淀用适量的Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L,pH 8.9)溶解,再用该缓冲液透析48 h。收集透析液,采用10 ku的超滤膜进行超滤(4 ℃)去除小分子蛋白,收集未透过部分,分装,于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 海参肠ALP活力的测定

参照Sigma公司的配制方法,将p-NPP溶于甘氨酸缓冲液(0.2 mol/L,pH 10.4)中配成10 mmol/L的底物溶液。碱性磷酸酶活力的测定参照Xiao等[8]和Pinoni等[13]的方法,并有所改进。具体方法如下:1 mL底物溶液中加入1 mL稀释过的酶液,于37 ℃下反应1 h,最后加入4 mL、0.4 mo1/L NaOH溶液终止反应,混匀后于405 nm下测定吸光度。以未加入酶液的溶液(用Tris-HCl缓冲液代替)作空白组。在此条件下,以每小时催化底物释放l μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个活力单位,以对硝基苯酚和牛血清蛋白标准品分别做标准曲线,计算海参肠碱性磷酸酶比活力。

1.3.3 海参肠ALP最适pH及pH稳定性的测定

坤二少爷哈哈一笑，说：“庄府门前的一棵枣树，满树红枣压弯了枝头，熟透的枣子落在地上无人去捡。如果这户人家有小孩子，树上树下会是这般光景？”

配制浓度为50 mmol/L,具有不同pH的溶液。分别为Gly-HCl缓冲液(pH 1.0～3.0),HAc-NaAc缓冲液(pH 4.0～6.0),Tris-HCl缓冲液(pH 7.0～8.0),Gly-NaOH缓冲液(pH 9.0～10.0),NaHCO3-NaOH缓冲液(pH 11.0～12.0),NaOH溶液(pH 13.0～14.0)。

测定最适pH时,取待测酶液加入Tris-HCl(pH 8.9)缓冲液中,稀释20倍。取出等量的酶液,用不同pH的缓冲液分别稀释酶液(1 000倍以上),按照“1.3.2”的方法测定酶活；测定pH稳定性时,稀释的酶液在室温静置1 h后,再按照“1.3.2”的方法测定酶活。

1.3.4 海参肠ALP最适温度及温度稳定性的测定

测定最适温度时,酶液用Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L,pH 8.9)稀释至一定倍数,分别于20～70 ℃与底物反应。测定温度稳定性时,先将稀释的酶液于20～70 ℃下保温1 h,再与底物反应,酶活测定方法同“1.3.2”。

1.3.5 金属离子对海参肠ALP活力的影响

取等量酶液,在反应体系中,分别加入Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、K+、Mn2+等金属离子,使其终浓度达到1和10 mmol/L。酶活测定方法同“1.3.2“,以未加入金属离子酶液的酶活力为100%,按照下式计算相对酶活力。

相对酶活力=加入金属离子的酶活力/未加入金属离子的酶活力×100%

1.3.6 抑制剂对海参肠ALP活力的影响

2 结果与讨论

2.1 海参肠ALP的提取

在提取海参肠ALP过程中,其纯化倍数和得率如表1所示,经正丁醇脱脂处理、硫酸铵沉淀及超滤浓缩后,海参肠ALP的比活力、纯化倍数呈逐渐增加的趋势,得率逐步下降,超滤浓缩后得到的海参肠ALP粗酶纯化倍数达到2.74倍,得率为63.32%。

表1 海参肠碱性磷酸酶的分离纯化

Tab.1 Isolation and purification of ALP from the gut of sea cucumber

纯化步骤m(总蛋白)/mg总活力/U比活力/(U·mg-1)纯化倍数得率/%粗酶液1 700.05 677.93.341.00100.00正丁醇处理728.94 967.76.822.0487.49硫酸铵处理(透析后超滤)392.73 595.09.152.7463.32

2.2 海参肠ALP的最适pH及其pH稳定性

由图1可知,海参肠ALP在酸性及中性条件下(pH 3.0～7.0)活力很低,pH 8.0～12时具有一定的酶活力,其中在pH 11.0时达到最大,随着pH的进一步提高,酶活力完全丧失(pH 13.0～14.0)。从图2可见,海参肠ALP在pH 10.0～12.0时稳定性较高。海参肠ALP的最适pH略高于其他来源的ALP(如中国对虾[14]、黄鳝[4]、鲍鱼[6]、鲢鱼[3]、三角帆蚌[15]中的ALP最适pH均在10.0左右),其pH稳定性范围相对狭窄,在pH 10.0～12.0范围内较稳定。

图1 pH对海参肠ALP活性的影响

Fig.1 Effect of pH on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

图2 pH对海参肠ALP稳定性的影响

Fig.2 Effect of pH on the stability of ALP from the gut of sea cucumber

2.3 海参肠ALP的最适温度及其温度稳定性

由图3可知,在20～45 ℃范围内,随着反应温度的升高,海参肠ALP活力逐渐增强,在45 ℃时达到最大值；随着温度的继续升高,酶活力逐渐下降。海参肠ALP的最适pH与其他动物来源的ALP相同,如从合浦珠母贝(Pinctadafucata)[8]和番鸭小肠[16]中提取得到的ALP,其最适温度均为45 ℃。图4显示了海参肠ALP在20～45 ℃有很高的稳定性,随着温度的继续升高,酶活力呈现快速下降的趋势,至60 ℃后酶活力完全丧失；而张继平等[17]通过研究发现草鱼ALP在45 ℃以下热变性,酶活力基本保持不变,在45 ℃以上酶活力开始下降,并随着处理温度升高,酶活力呈快速下降。

图3 温度对海参肠ALP活性的影响

Fig.3 Effect of temperature on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

图4 温度对海参肠ALP稳定性的影响

Fig.4 Effect of temperature on the stability of ALP from the gut of sea cucumber

2.4 金属离子对海参肠ALP的影响

ALP是一种金属酶,金属离子对维持其分子构象和催化活性有重要作用。按“1.3.5”所述方法测定不同金属离子对海参肠ALP活性的影响,结果如表2所示。由表2可知,在1和10 mmol/L的浓度下,Zn2+和Mg2+对海参肠ALP有明显的激活作用,Ca2+对其有略微激活作用,而Cu2+可抑制其活性；Fe2+、Fe3+和Mn2+在低浓度下(1 mmol/L) 对海参肠ALP有略微或明显的激活作用,而在高浓度下(10 mmol/L)则显著抑制该酶活力。Dong和Zeikus等[18]通过研究新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)中的碱性磷酸酶,也得出2 mmol/L 的Zn2+、Mg2+和Ca2+对ALP有激活作用。Chen等[19]通过研究不同金属离子对锯缘青蟹ALP活性影响,发现Cu2+、Mn2+等重金属离子对其有抑制作用,但Zn2+也对ALP有抑制作用,当其浓度为20 μmol/L时,剩余酶活力为80%,并随浓度的增加剩余酶活力逐渐减少。

表2 金属离子对海参肠ALP的影响

Tab.2 Effect of metal ions on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

金属离子c/(mmol·L-1)相对酶活力/%c/(mmol·L-1)相对酶活力/%Zn2+1133.410119.7Fe2+1101.91058.7Fe3+1109.41060.6Mg2+1131.510166.9Ca2+1106.110104.3Cu2+193.11072.8Mn2+1133.51078.9

考察不同浓度Zn2+、Mg2+对海参肠ALP活力的影响,所得结果如图5所示。海参肠ALP的活力随着Zn2+浓度增大而逐渐减少,并且在Zn2+浓度达到15 mmol/L后对ALP的影响表现为抑制作用。随着Mg2+浓度的增加,海参肠ALP的活力也逐渐增大,当Mg2+浓度达到30 mmol/L时,海参肠ALP活力增加了99.1%。

2.5 抑制剂对海参肠ALP的影响

图5 Zn2+和Mg2+浓度对海参肠ALP活力的影响

Fig.5 Effect of concentrations of Zn2+and Mg2+on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

图6 抑制剂对海参肠ALP的影响

Fig.6 Effect of inhibitors on the activity of ALP from the gut of sea cucumber

3 结 论

(1)海参肠碱性磷酸酶粗酶的最适反应温度为45 ℃,在20～45 ℃范围内有很高的稳定性。

(2)海参肠碱性磷酸酶粗酶的最适pH为11,在pH 10.0～12.0范围内表现出较高的稳定性。

(3)金属离子Mg2+(1～30 mmol/L)、Zn2+(<10 mmol/L)对海参肠ALP粗酶有显著的激活作用,Fe3+、Fe2+、Cu2+和Mn2+(10 mmol/L)可明显抑制该酶活力。

(4)EDTA-Na2、DTT、Na2WO4及Na2HPO4对海参肠ALP粗酶有明显的抑制作用,抑制程度依次为:EDTA-Na2>DTT>Na2WO4>Na2HPO4。

[1] de BACKER M, MCSWEENEY S, RASMUSSEN H B, et al. The 1.9 A crystal structure of heat-labile shrimp alkaline phosphatase[J]. Journal of Molecular Biology, 2002, 318(5):1265-1274.

[2] 张辉,张海莲. 碱性磷酸酶在水产动物中的作用[J]. 河北渔业, 2003, 131(5):12-13.

[3] 许敏. 白鲢肠碱性磷酸酶的分离纯化及其性质研究[D]. 重庆:西南大学, 2007.

[4] 黄毅. 黄鳝肝脏碱性磷酸酶的分离纯化及部分动力学性质研究[J]. 水产科学, 2009, 28(6):313-316.

[5] 唐云明. 泥鳅碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质[J]. 水产学报, 1998, 21(3):336-339.

[6] 廖金花,陈巧,林丽蓉,等. 鲍鱼碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究[J]. 厦门大学学报:自然科学版, 2005, 44(2):273-275.

[7] 张洪渊,刘克武,姜云,等. 背角无齿蚌碱性磷酸酶的功能基团研究[J]. 水生生物学报, 1997, 21(4):48-352.

[8] XIAO Rui, XIE Li-pin, LIN Jing-yu, et al. Purfication and enzymatic characterization of alkaline phosphatase fromPinctadafucata[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2002, 17:65-74.

[9] 陈清西,张喆,庄总来,等. 锯缘青蟹碱性磷酸酶分离纯化及部分性质研究[J]. 海洋与湖沼, 1998, 29(4):62-367.

[10] 李兴暖,韩雅莉,肖湘,等. 长牡蛎碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究[J]. 台湾海峡, 2003, 22(4):483-486.

[11] NILSEN I W, ØVERbØ K, OLSEN R L. Thermolabile alkaline phosphatase from Northern shrimp (Pandalusborealis):protein and cDNA sequence analyses[J]. Comparative Biochemstry and Physiology Part B, 2001, 129(4):853-861.

[12] 欧阳培,陈晓鹭,钱海年. 扇贝碱性磷酸酶的分离提纯及性质研究[J]. 热带海洋, 1986, 5(3):50-56.

[13] PINONI S A, GOLDEMBERG A L, LOPEZ MANANES A A. Alkaline phosphatase activities in muscle of the euryhaline crabChasmagnathusgranulatus:Response to environmental salinity[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2005, 326:217-226.

[14] 何海琪,孙凤. 中国对虾酸性和碱性磷酸酶的特性研究[J]. 海洋与湖沼, 1992, 23(5):555-560.

[15] 万谦,张洪渊. 三种淡水育珠蚌碱性磷酸酶比较酶学的初步研究[J]. 四川大学学报, 1994, 31(2):264-268.

[16] 刘建昌,余万凯,池雪林,等. 番鸭小肠碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究[J]. 福建农林大学学报, 2010, 39(2):165-167.

[17] 张继平,林建成,谢进金,等. 草鱼碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质研究[J]. 厦门大学学报:自然科学版, 2005, 44(5):684-687.

[18] DONG Guo-qiang, ZEIKUS J G. Purification and characterization of alkaline phosphatase fromThermotoganeapolitana[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1997, 21:335-340.

[19] CHEN Qing-xi, ZHENG Wen-zhu, LIN Jing-yu, et al. Effect of metal ions on the activity of green crab (Scryllaserrata) alkaline phosphatase[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2000, 32(8):879-885.