对羟基联苯比色法测定葡萄酒发酵过程中的乳酸

杨 江 威, 王 越, 安 家 彦

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

乳酸是葡萄汁酒精发酵的主要副产物之一,其酸味较弱,可使葡萄酒口感变得柔和,在葡萄酒中乳酸的质量浓度一般低于1 g/L[1]。目前乳酸定量测定的方法主要有毛细管电泳法、EDTA定钙法、酶法、HPLC分析法和酶电极生物传感器法,其中毛细管电泳法操作简单、用样量少、时间短,受其他非离子组分干扰较少,定量较准确,但是分析过程中所用缓冲液较复杂；EDTA定钙法对样品的预处理较复杂；酶法和HPLC分析法对实验操作条件及费用要求均较高；酶电极生物传感器法具有快速、专一、简便的特点,不需要分离可直接测定,但是所用仪器成本太高。此外有文献报道采用对羟基联苯比色法测定白酒[2]、啤酒[3]和尿液[4]中的微量乳酸浓度。此方法所用仪器操作简便、特异性好、灵敏度高、实用性强,但对葡萄酒中乳酸的定量检测还未见报道。

本研究采用对羟基联苯比色法对葡萄汁发酵过程中的乳酸进行定量测定,研究了测定方法的精密度、回收率和测定过程中其他有机酸的影响,探讨了葡萄酒酒精发酵过程中乳酸的变化情况。

1 材料与方法

1.1 菌 种

葡萄酒酵母,为本实验室保藏菌种,保存在YEPD斜面培养基上,每2个月转接1次。

1.2 主要试剂

乳酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、偏重亚硫酸钾、乳酸锂、硫酸铜、氢氧化钙、氢氧化钠、对羟基联苯、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、亚硫酸钠、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、氯化钙,均为分析纯试剂；玉米浆,浓硫酸。

1.3 培养基

斜面培养基(g/L):酵母膏10,蛋白胨20,葡萄糖20,琼脂20,加蒸馏水定容至1 000 mL,pH 6.0、115 ℃湿热灭菌20 min。

1.4 乳酸的测定

采用对羟基联苯比色法[3-4]测定乳酸。

1.5 酵母干重的测定

采用光电比浊法[5]测定酵母干重。

1.6 还原糖的测定

采用DNS法[6]测定发酵液中还原糖。

1.7 种子培养液的制备

取斜面培养基上葡萄酒酵母2环接入装有50 mL糖度为2%的葡萄汁的250 mL三角瓶中,28 ℃培养36 h,每12 h振荡1次[7]。

1.8 不同品种葡萄汁的酒精发酵

浓缩巨峰葡萄汁和浓缩白葡萄汁的糖浓度均为60%,按还原糖可生成酒精量为12%(Vol)进行稀释,均加入60 mg/L的SO2防止葡萄汁氧化,同时起到抑菌作用。用1 000 mL三角瓶发酵,装液量为600 mL,将种子培养液按5%(体积分数)的量[8]接种到葡萄汁中,装发酵栓,将巨峰葡萄汁和白葡萄汁分别在25和20 ℃发酵15 d,定时取样,测定发酵液中乳酸的浓度。

1.9 发酵液样品中乳酸的测定

将葡萄汁发酵液稀释70倍,按照方法“1.4”测定发酵液中的乳酸,并按下式计算。

ρ=(OD565-b)N/k

式中,ρ为乳酸质量浓度，mg/L；OD565为在波长565 nm下测得的吸光值；b为标准曲线的截距；N为稀释倍数；k为标准曲线的斜率。

2 结果与分析

2.1 乳酸标准曲线的测定

分别准确配制5、10、15、20、25、30 μg/mL乳酸标准溶液,按照方法“1.4”进行测定,以乳酸浓度为横坐标,以OD值为纵坐标,得到回归方程为y=0.010 9x+0.115,R2=0.991 6。

2.2 乳酸测定方法的精密度

将葡萄汁发酵液稀释70倍,取6个平行样,在565 nm下测其吸光值,结果如表1所示。

表1 乳酸测定方法的精密度

6个样品的OD值相对标准偏差为1.213%,表明对羟基联苯比色法测定乳酸的精密度较高。

2.3 其他有机酸对乳酸测定的影响

在4份25 mL 0.5 g/L的乳酸溶液中,分别加入苹果酸102.5 mg、柠檬酸7.78 mg、酒石酸119.55 mg[9]、琥珀酸12.5 mg,混匀,稀释70倍,在565 nm下测其吸光值,结果如表2所示。

表2 其他有机酸对乳酸测定的影响

Tab.2 Effects of other organic acids on determining lactic acid

样品OD565乳酸乳酸+柠檬酸乳酸+苹果酸乳酸+酒石酸乳酸+琥珀酸0.1030.1140.1050.1000.121

由表2数据可知,苹果酸、柠檬酸和酒石酸对乳酸的测定影响很小。但是琥珀酸对乳酸的测定的影响较大,琥珀酸不存在于葡萄浆果中,它主要来源于酒精发酵[10],在葡萄酒中的浓度很小,所以对乳酸测定的影响可忽略不计。

2.4 乳酸测定方法的回收率

在葡萄汁发酵液中加入不同量的乳酸标准溶液,稀释70倍,测定结果如表3所示。

表3 乳酸测定方法的回收率

由表3可知,回收率范围为98.10%～103.05%,平均回收率为100.46%,本法定量测定发酵液中的乳酸准确度较高。

2.5 酒精发酵过程中乳酸的消长

考查不同品种葡萄汁酒精发酵过程中乳酸的消长,其中白葡萄汁初始糖质量浓度为192.827 g/L,巨峰葡萄汁初始糖质量浓度为166.423 g/L,分别在20和25 ℃进行酒精发酵,定时取样,分别按照方法“1.4”、“1.5”和“1.6”测定乳酸的质量浓度、酵母干重和还原糖质量浓度,结果分别如图1和2所示。

图1 白葡萄汁中的酒精发酵过程

Fig.1 Alcoholic fermentation process of white grape juice

图2 巨峰葡萄汁中的酒精发酵过程

Fig.2 Alcoholic fermentation process of Kyoho grape juice

由图1、2可知,白葡萄汁在刚接入种子培养液时,乳酸的质量浓度为0.310 g/L,而巨峰葡萄汁中没有检出乳酸。随着发酵过程的进行,酵母干重逐渐增加,还原糖逐渐消耗,两种葡萄汁发酵液中乳酸生成量均逐渐增加。由图1可知,当白葡萄汁发酵第8天时,乳酸的质量浓度达到最大值；第11～18天,乳酸的生成量趋于稳定。由图2可知,发酵3 d后酵母干重迅速增加,还原糖的消耗量也迅速增加,此时一部分的糖被用于酵母生长繁殖,另一部分用于生成酒精；发酵3 d 后乳酸质量浓度以每天0.1 g/L的速度增加,第10天达到最大值,其后稍有下降并渐趋于稳定。有文献报道葡萄酒中乳酸的质量浓度一般低于1 g/L,由不同品种葡萄汁酒精发酵的实验数据可知,乳酸生成量的最大值分别为1.424 和1.188 g/L,均大于1 g/L,表明葡萄酒中的乳酸大部分是在酒精发酵过程中产生的。

3 结 论

采用对羟基联苯比色法测定葡萄汁在酒精发酵过程中乳酸的生成量,结果表明,此方法的相对标准偏差为1.213%；回收率范围为98.10%～103.05%,平均回收率为100.46%；其他有机酸对乳酸测定影响研究表明,酒石酸、柠檬酸、苹果酸均无大影响,琥珀酸对乳酸测定的影响稍大,而琥珀酸在葡萄酒中的浓度是微量的,对乳酸测定的影响可忽略不计,所以采用此方法测定葡萄酒中乳酸的含量结果真实可信。

同时采用此比色法对不同品种的葡萄汁在酒精发酵过程中乳酸的生成量进行跟踪测定,结果表明,随着酵母干重的增加,还原糖的消耗,乳酸呈增长趋势；当乳酸的生成量达到最大值后均稍有下降,随后又趋于稳定,并且两种葡萄汁在酒精发酵过程中乳酸质量浓度的最大值均大于1 g/L,表明乳酸的生成大部分是在酒精发酵过程中进行的。

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