rAd-p53瘤内注射联合放化疗前后鼻咽癌原发灶细胞凋亡的变化

兰桂萍 司勇锋 韦海明 何宁 覃扬达 黄波 何承诚

鼻咽癌是我国常见的头颈部鳞癌。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段，但中晚期鼻咽癌因肿瘤负荷大，治疗后局部复发和远处转移率高。rAd-p53是通过腺病毒载体将野生型p53基因转导入肿瘤细胞发挥治疗效应[1]，可协同放化疗发挥作用。为了解rAd-p53联合放化疗治疗中晚期鼻咽癌的治疗效果，本文主要对治疗前后的鼻咽部肿瘤组织标本进行细胞凋亡原位检测（TUNEL法）。

1 材料与方法

1.1 临床资料 本组61名病例源于广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科在2007年01月～2010年06月收治的部分鼻咽癌患者，男50例，女11例，年龄在22～63岁之间，中位年龄42岁。全部病例经病理诊断为未分化非角化性癌，均行鼻咽颅底CT（或MRI）、B超、X线及鼻内镜检查了解病变范围；按UICC（1997）鼻咽癌分期方案分期的Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者；年龄在20～65岁之间；卡氏评分≥70分；签署知情同意书。全部病例随机分为2组，治疗组：rAd-p53瘤内注射+同步放化疗，对照组：同步放化疗。两组病例之间年龄、性别、临床分期、T分期、N分期间差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 放射治疗：采用西门子Primus全数字化直线加速器常规体外照射，采用面颈联合野照射36Gy后缩野，采用耳前野辅以鼻前野，原发灶70～76Gy/35f/7～8w，颈转移灶60～70Gy。

化学药物治疗：卡铂+5-Fu方案。剂量按体表面积计算，卡铂500mg·（m2·d）-1，d1静脉点滴，5-Fu 500mg·（m2·d）-1，d1-5，24小时微泵持续输入，与放疗同步进行，21天后重复化疗1次，共2个周期。

rAd-p53瘤内注射：重组人p53腺病毒注射液（rAd-p53,中国深圳赛百诺公司生产）剂量：1×1012VP/支，1次/周，治疗6～8周；用法：用生理盐水稀释rAd-p53到2ml后使用，在鼻内镜直视下分3点注入鼻咽部原发灶内；用药时间：于放疗前48～72小时行瘤内注射。

1.2.2 鼻咽癌原发灶标本采取及处理 分别于治疗前及放疗至20Gy（第3次rAd-p53瘤内注射后）获取活体组织标本。用1%麻黄素液和1%的卡因液棉片行鼻腔、鼻咽部粘膜麻醉，在鼻内镜直视下于鼻咽部瘤体处应用活检钳获取活体组织标本。全部标本经10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋。TUNEL凋亡试剂盒购于美国罗氏公司，DAB显色试剂盒购于北京中杉生物技术公司。TUNEL染色：常规脱蜡脱水，过氧化氢封闭后，微波处理230分钟。TDT酶、biodUTP37℃孵育1h。生物素标记-HRP37℃孵育1h。DAB显色、树封、脱水、封片。用已知的阳性对照片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 观察指标 凋亡指数：细胞核染成棕褐色为凋亡细胞，随机选取肿瘤区域，在高倍镜（40×10）下，计数1000个肿瘤细胞中的阳性细胞数，计算出凋亡指数（AI）（AI=凋亡细胞数/肿瘤细胞数×100%）。随访时间是2007年01月～2011年01月，随访方式是患者定期回院复查和专职随访员电话随访。

1.3 统计学方法 所有分析均使用SPSS13.0统计学软件进行，计量资料以(±s)表示，组间采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

治疗前后的细胞凋亡指数（AI）的变化 对照组治疗前后的AI分别为（4.455±1.670）%、（8.252±4.076）%，治疗组治疗前后的AI分别为（4.453±1.670）%、（13.370±6.957）%，治疗组治疗前后、对照组治疗前后、治疗组与对照组治疗后AI有统计学差异（P＜0.05）。（见表1）。

表1 两组患者治疗前后鼻咽癌原发灶细胞凋亡指数对比情况

3 讨论

目前放化疗成为中晚期鼻咽癌的主要治疗手段。但因中晚期鼻咽癌肿瘤较大，其中不乏大量的乏氧细胞，对放化疗并不敏感，而我们将rAd-p53联合同步放化疗应用于治疗中晚期鼻咽癌患者却获得了较好的临床效果[2]。

细胞凋亡是一种具有特定形态和生化改变的细胞死亡过程。p53基因的产物p53蛋白的主要功能是维护细胞基因组的稳定，在参与细胞周期调节，诱导细胞凋亡的过程发挥着关键性的作用。当细胞DNA出现损伤时，p53蛋白活化，可以阻滞细胞周期，修复细胞DNA；当细胞DNA损伤无法修复的时候，p53蛋白可以上调促凋亡基因，下调抗凋亡基因，进而启动细胞凋亡程序，诱导细胞凋亡[3]；p53蛋白还可以直接刺激Bax蛋白或者caspase-8，不经转录调控途径直接启动细胞凋亡程序。放疗和化疗对肿瘤细胞的杀伤效应主要依赖p53基因途径引发的细胞凋亡实现的[4]。rAd—p53不仅具有独立的抑制多种肿瘤生长的作用，还可以通过激活bax基因、抑制bcl—x基因以及诱导前凋亡基因puma、bak、fas的表达，促进细胞凋亡，提高多种肿瘤细胞对化、放疗的敏感性[5]。

我们的研究发现对照组同步放化疗，细胞凋亡指数明显增高，治疗前后有统计学差异，说明放化疗后具有诱导细胞凋亡的作用；但治疗组治疗前后细胞凋亡指数增高更明显，而且治疗组与对照组治疗后的细胞凋亡指数比较具有显著性的统计学差异，说明导入肿瘤细胞内的rAd-p53基因与放化疗一样发挥了诱导细胞凋亡的作用，而且与放化疗具有协同治疗作用。而我们的临床研究也证实[6]，rAd-p53瘤内注射联合同步放化疗治疗中晚期鼻咽癌患者可获得更好的肿瘤完全缓解率。Pan等[7]应用rAd-p53联合放疗治疗鼻咽癌病人的6年随访资料显示rAd-p53可以更好控制鼻咽癌的发展和提高生存率。可见rAd-p53瘤内注射联合同步放化疗治疗中晚期鼻咽癌可以取得更好的治疗效果。

[1]张珊文.中国p53基因治疗的现状和前景[J].医学研究杂志，2008，37（6）：3-5.

[2]司勇锋,何承诚,兰桂萍.重组人p53腺病毒注射液联合放化疗对中晚期鼻咽癌消退率的影响[J].中国肿瘤临床，2009，36（18）：1031-1033.

[3]Smith ND,Rubenstein JN,Eggener SE,et al.The p53 tumor suppressor gene and nuclear protein:basic science review and relevance in the management of bladder cancer[J]. J Urol,2003,169(4):1219-1228.

[4]Dey A,Verma CS,Lane DP.Updates on p53:modulation of p53 degradation as a therapertic approch[J].Br J Cancer,2008,98(1):4-8.

[5]张跃伟，娜仁图戈，李闯，等.内镜下rAd—p53注射联合动脉灌注治疗进展期胃癌[J].当代医学,2010,16(11):171-172.

[6]兰桂萍，苏纪平，司勇锋，等.重组人p53腺病毒联合放化疗治疗中晚期鼻咽癌的临床观察[J].实用医学杂志，2011，27（13）：2341-2344.

[7]Pan JJ,Zhang SW,Chen CB,et al.Effect of recombinant Adenovirus-p53 Combined With Radiotherapy on Long-Time Prognosis of Advanced Nasopharyngeal Carcinoma[J].J Chin Oncol,2009,27(5)：799-804.