雷公藤内酯醇对慢性脑缺血模型大鼠海马突触素和突触后致密物95的影响

潘发福 梁明春 刘卉芳 吕 诚 胡小令 万 斌 杨宝林 聂 菁

(南昌大学医学院解剖学教研室，江西 南昌 330006)

慢性脑缺血(CCI)所致的免疫炎症反应可引起神经元变性死亡，损害突触可塑性，从而构成了CCI导致认知功能损害的重要病理生理基础〔1〕。突触素(SYN)是突触前囊泡上的一种蛋白质，参与神经递质的释放，是突触终末的特异性标记物〔2〕。突触后致密物95(PSD-95)是突触后致密物中含量最丰富的骨架蛋白，在突触后膜受体定位和信号传导通路中发挥重要的作用。雷公藤提取物雷公藤多甙可以改善CCI大鼠认知功能〔3〕。本实验通过双侧颈总动脉永久性结扎法(2-VO)建立CCI动物模型，选取突触相关的两种蛋白(SYN、PSD-95)作为检测指标，进一步探讨雷公藤多甙的主要成分雷公藤内酯醇对CCI模型大鼠突触可塑性的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 雷公藤内酯醇(纯度为99.8%，批号070929，福建省医学科学研究所，溶于4%丙二醇溶液中);SP试剂盒(Zymed公司);DAB显色试剂盒(北京中杉公司);SYN、PSD-95兔抗(北京博奥森生物技术有限公司);PCR扩增用引物(上海生物工程有限公司);2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司);RevertAidTM HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit(Formentas公司);快速恒温冰冻切片机YD-1508Ⅲ(浙江金华益迪医疗设备厂);Image.Pro Plus v5.1显微图像分析系统(Media Cybernetics公司);MG25+基因扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型建立 取30只4月龄、体重250～275 g的健康雄性SD大鼠(南昌大学实验动物科学部提供)，随机分成:对照组、模型组、治疗组。模型组和治疗组大鼠采用2-VO建立CCI模型:腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，常规碘附消毒，取颈部正中切口，分离出颈总动脉，永久性结扎双侧颈总动脉，确认结扎稳妥后用无菌生理盐水清洗伤口，检查伤口，无明显出血后用1号丝线逐层缝合切口。对照组大鼠暴露双侧颈总动脉后1号丝线从其底部穿过但不结扎，清洗伤口后逐层缝合切口。

1.2.2 实验动物用药 术后治疗组大鼠每日腹腔注射雷公藤内酯醇0.4 mg/kg，模型组和对照组大鼠每日腹腔注射等容积4%丙二醇溶液，连续注射28 d。

1.2.3 甲苯胺蓝尼氏染色和免疫组织化学染色 每组各取5只大鼠，麻醉后行心脏灌注，0.9%生理盐水冲洗后灌入4%多聚甲醛磷酸缓冲液，取脑组织，外固定后放入30%蔗糖磷酸缓冲液中，完全沉底后留取从前囟后3.3～4.3 mm间的背侧海马作连续冠状冰冻切片，片厚20 μm，分别行甲苯胺蓝尼氏染色和SYN、PSD-95免疫组织化学染色。免疫组织化学染色(SP法):3%H2O2去离子水，孵育10 min;正常山羊封闭血清室温孵育20 min，倾去;分别滴加稀释浓度为1∶100的SYN和1∶200的PSD-95一抗4℃过夜;PBS替代一抗作阴性对照;生物素化二抗37℃孵育30 min;辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育30 min;DAB显色剂避光染色10 min;每只大鼠随机抽取5张切片，在海马CA1区随机抽取5个不相重叠的视野，显微镜(×400)下采用Image.Pro Plus v5.1显微图像分析系统检测出SYN的阳性产物数量和PSD-95的阳性细胞数及其各自平均光密度。

1.2.4 RT-PCR①RNA的提取 每组各取5只大鼠，麻醉后断头，快速取出海马组织，TRIzol法提取总RNA;使用紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm波长的光吸收值，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间。②逆转录反应:按试剂盒说明合成cDNA。③PCR扩增:β-actin上游引物:5'-GGT ATG GGT CAG AAG GAC TCC-3'，下游引物:5'-TGA TCT TCA TGG TGC TAG GAG CC-3'，扩增片段长度857 bp。SYN上游引物:5'-AAC AAA GGG CCT ATG ATG GA-3'，下游引物:5'-CCA GGT TCA GGA AGC CAA-3'，扩增片段长度232 bp。PSD-95上游引物:5'-GCC CTG TTT GAT TAC GAC AA-3'，下游引物5'-CTC ATA GCT CAG AAC CGA GT-3'，扩增片段长度250 bp。反应条件:94℃预变性 4 min，94℃ 变性 30 s，58℃ 退火 45 s，72℃ 延伸1 min，30个反应循环，结束72℃充分延伸5 min。④产物测定:1.2%的琼脂糖凝胶，取RT-PCR产物6 μl上样电泳，150 v，45 min。紫外线透射仪观察并拍照。以SYN/β-actin、PSD-95/β-actin表示产物的相对含量。

2 结果

2.1 甲苯胺蓝尼氏染色 对照组大鼠海马CA1区锥体层神经元数目和形态未见明显改变，细胞呈锥形，排列规则，界限清晰;模型组大鼠海马CA1区锥体层神经元数目较对照组明显减少，细胞呈不规则形，细胞界限不清，间隙增大，胞内尼氏体减少;治疗组大鼠海马CA1区锥体层神经元损伤程度较模型组轻，胞内尼氏体也较模型组增加。见图1。

2.2 SYN免疫组织化学染色 对照组大鼠海马CA1区分子层SYN阳性产物呈颗粒状分布，染色深且分布均匀;模型组大鼠海马CA1区分子层SYN阳性产物染色浅，数目少且分布不均匀，与对照组相比，模型组大鼠海马CA1区分子层SYN阳性产物数量明显减少(P＜0.01)，平均光密度明显降低(P＜0.01);治疗组大鼠海马CA1区分子层SYN阳性产物染色较深，数目较多，与模型组相比，治疗组大鼠海马CA1区分子层SYN阳性产物数量明显增多(P＜0.01)，平均光密度明显增强(P＜0.01)。见表1，图2。

图1 各组大鼠海马CA1区锥体层神经元(甲苯胺蓝尼染色，×400)

图2 各组大鼠海马CA1区分子层SYN阳性细胞(免疫组织化学染色，×400)

表1 各组大鼠海马CA1区SYN表达(± s，n=5)

表1 各组大鼠海马CA1区SYN表达(± s，n=5)

与对照组比较:1)P＜0.01，与模型组比较:2)P＜0.01;下表同

组别 阳性产物数 平均光密度对照组232.4±15.79 0.210 9±0.009 8模型组 121.1±12.281) 0.142 8±0.014 41)治疗组 190.7±19.551)2) 0.183 5±0.008 21)2)

2.3 PSD-95免疫组织化学染色 对照组大鼠海马CA1区锥体层PSD-95阳性细胞分布较密集，呈锥形，可见轴突和树突样突起;模型组大鼠海马CA1区锥体层PSD-95阳性细胞数和平均光密度明显低于对照组(P＜0.01);治疗组大鼠海马CA1区锥体层PSD-95阳性细胞数和平均光密度明显高于模型组(P＜0.01)。见表2，图3。

表2 各组大鼠海马CA1区PSD-95表达(± s，n=5)

表2 各组大鼠海马CA1区PSD-95表达(± s，n=5)

组别 阳性细胞数 平均光密度对照组34.60±2.650 0.288 3±0.016 7模型组 21.74±2.6331) 0.234 4±0.018 41)治疗组 30.64±3.6181)2) 0.259 5±0.016 31)2)

2.4 SYN和PSD-95mRNA的表达 RT-PCR和凝胶电泳显示，在232 bp片段大小位置可见SYN mRNA阳性条带，在250 bp片段大小位置可见PSD-95 mRNA阳性条带。模型组大鼠海马组织SYN和PSD-95 mRNA相对含量明显低于对照组(P＜0.01)，治疗组大鼠海马组织SYN和PSD-95 mRNA相对含量明显高于模型组(P＜0.01)。见表3，图4，图5。

图3 各组大鼠海马CA1区锥体层PSD-95阳性细胞(免疫组织化学染色，×400)

表3 各组大鼠海马SYN和PSD-95 mRNA的表达水平(± s，n=5)

表3 各组大鼠海马SYN和PSD-95 mRNA的表达水平(± s，n=5)

组别SYN mRNA PSD-95 mRNA对照组0.564 3±0.037 8 0.748 7±0.041 2模型组 0.257 9±0.009 91) 0.352 7±0.025 91)治疗组 0.458 5±0.0251)2) 0.655 5±0.021 51)2)

图4 各组大鼠海马组织SYN RT-PCR结果

图5 各组大鼠海马组织PSD-95 RT-PCR结果

3 讨论

有研究证实CCI中星形胶质细胞增生并活化，活化的星形胶质细胞的在缺血损伤后可分泌大量的细胞因子等炎性介质，参与CCI所致的脑损伤〔4〕。Farkas等〔5〕研究表明脑缺血后还可激活小胶质细胞。激活的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2的表达增加，导致其诱导产物一氧化氮、前列腺素E2大量合成〔6〕。激活的神经胶质细胞分泌的免疫炎性介质，反过来又可进一步激活神经胶质细胞，从而形成正反馈环路，促成CCI脑内慢性免疫炎症反应的形成和炎性产物的持续升高，导致神经元变性、损伤和死亡〔7〕。我实验室同期实验证实了CCI后神经胶质细胞增殖并激活。本实验表明本实验室制作的CCI模型大鼠模拟了神经元损伤、神经胶质细胞增生等病理改变。

SYN参与神经递质释放和突触囊泡循环，与突触的重建及认知过程密切相关〔2〕。Schmitt等〔8〕研究SYN表达水平变化与学习记忆之间的关系，结果显示海马部神经元缺血后变性坏死，SYN阳性产物表达明显减少，大鼠学习和记忆能力均下降。王冰等〔9〕利用2-VO法建立血管性痴呆模型小鼠，发现海马区PSD-95免疫阳性产物减少。本实验结果与上述文献报道一致。CCI后SYN和PSD-95表达减少的原因可能有:①CCI所致的免疫炎症反应引起神经元变性死亡，而后者可导致突触的丢失;②CCI后受损神经元的代谢活动减弱和蛋白质的合成能力下降;③CCI所致的免疫炎症反应直接损害突触可塑性〔10〕。

雷公藤内酯醇能够减少炎症因子的表达，具有明显的抗炎和神经保护作用，能促进突触功能以及促进髓鞘形成，还能改善记忆和认知功能〔11〕。本实验提示雷公藤内酯醇可能通过抑制CCI引起的免疫炎症反应，促进大鼠海马神经元SYN和PSD-95的表达，对突触的可塑性起到一定的保护作用。

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8 Schmitt U，Tanimoto N，Seeliger M，et al.Detection of behavioral alterations and learning deficits in mice lacking synaptophysin〔J〕.Neuroscience，2009;162(2):234-43.

9 王 冰，王 佩，康 军，等.血管性痴呆小鼠海马突触后致密物95表达的研究〔J〕.脑与神经疾病杂志，2007;15(4):258-69.

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