正交试验优化HPLC测定齐墩果酸与熊果酸的色谱条件

卢桂英，孙贺略，杨雪滢，胡旭芳，马志刚，曹秋娥

(云南大学化学科学与工程学院教育部自然资源药物化学重点实验室，云南昆明650091)

正交试验优化HPLC测定齐墩果酸与熊果酸的色谱条件

卢桂英，孙贺略，杨雪滢，胡旭芳，马志刚，曹秋娥

(云南大学化学科学与工程学院教育部自然资源药物化学重点实验室，云南昆明650091)

为建立简单、快速的分离测定齐墩果酸与熊果酸的HPLC方法，实验采用L16(44)的正交试验设计表，对HPLC分离测定齐墩果酸与熊果酸的主要影响因素(甲醇与水相的体积比、水相中乙酸和三乙胺的体积分数以及流动相流速)进行了优化.结果表明，以体积比为90∶10的甲醇与含有0.5%乙酸及0.01%三乙胺的水相混合溶液为流动相，流速为0.8 mL/min，齐墩果酸和熊果酸可以在16 min内得到有效分离，其工作曲线的线性范围对于齐墩果酸为2.5～340.0 μg/ mL，对于熊果酸为5.0～340.0 μg/mL.将方法应用于女贞子和山楂中齐墩果酸和熊果酸含量的测定，相对标准偏差均小于2.0%，加样回收率均在95%～105%之间.

正交试验设计;高效液相色谱;齐墩果酸;熊果酸

正交试验设计(orthogonal design)是利用正交表科学地安排与分析多因素试验，并对结果进行统计分析，从而得出最优化实验条件的试验设计方法之一，它能较全面地反映试验因素的影响情况，以相当少的试验次数得到满意的实验结果，因此在很多领域如光谱及色谱分析的样品前处理、合成化学、植物有效成分提取等中都得到了广泛应用［1－3］，但采用该方法对高效液相色谱法(HPLC)分离测定齐墩果酸与熊果酸的条件进行优化的研究还未见报道.目前，用HPLC同时分析测定熊果酸与齐墩果酸这2个同分异构体的研究已有不少报道［4－13］，但这些方法的分析时间大多数都超过了20 min［9－13］，其原因应该是色谱条件没有得到充分优化.因此，本文采用了正交试验设计对HPLC分离测定熊果酸与齐墩果酸的条件进行了优化，并最终在16 min内实现了熊果酸与齐墩果酸的有效分离与测定.与部分文献报道的测定这2个组分的HPLC方法相比［6－13］，本法的分析时间较短，而且其分离度好、线性范围宽，能用于女贞子和山楂中熊果酸与齐墩果酸的准确测定.

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Waters1525－HPLC色谱仪(美国Waters公司)带Waters 2996 PAD二极管阵列检测器、Waters717 plus Autosampler自动进样器、Waters C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)及Enpower中文色谱工作站.

熊果酸和齐墩果酸均购于南京朗科医药有限公司，色谱纯甲醇购于美国Fisher公司，实验所用其它试剂均为分析纯，水为艾柯纯水器UP级水.

1.2 溶液的制备

标准溶液的制备:熊果酸与齐墩果酸的标准溶液由甲醇配制.

样品溶液的制备:准确称取干燥、粉粹过0.301 mm不锈钢筛布的女贞子或山楂样品1～3 g，加12 mL甲醇浸泡3 h，然后超声提取30 min，过滤.残渣再用12 mL甲醇重复提取1次.合并2次提取的滤液，用甲醇定容于25.0 mL容量瓶中，摇匀.提取液在用HPLC分析前用0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤.

1.3 HPLC测定条件

色谱柱:Waters symmetry columns C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相∶体积比为90∶10的甲醇与含有0.5%乙酸及0.01%三乙胺的水相混合溶液;流速:0.8 mL/min;检测波长:210 nm;进样量:10 μL;柱温:25℃.

2 结果与讨论

2.1 正交试验设计优化色谱分离条件

为了简化色谱条件的优化过程，尽量得到理想的分离条件，实验采用了正交试验设计优化色谱条件.初步实验后发现，采用甲醇－水为流动相时，在水相中加入少量乙酸和三乙胺对分离有改善作用.因此，实验采用了甲醇与水相的体积比(A)、水相中乙酸体积分数(B)、水相中三乙胺体积分数(C)、流动相流速(D)4个因素，每个因素分别取4个水平(见表1)的L16(44)正交实验设计表进行实验设计，并按照表2共进行了16次实验，这16次实验测定得到的齐墩果酸和熊果酸的保留时间及分离度同样列于表2中.

表1 正交试验设计各因素水平表

表2 HPLC条件优化的L16(44)实验结果

考虑到快速分析与有效分离的需要，实验分别选择了分析时间(以后面出峰的熊果酸的保留时间表示)和两组分的分离度为评价指标，用极差分析法对正交实验结果进行了分析，结果从表3可以看出，以分离度和分析时间为评价指标，得到的分析结果是不一致的.在所试验的因素及其水平下，对分离度影响最大的是流动相中甲醇与水相的体积比，最小的是水相中三乙胺的体积分数;对分析时间影响最大的也是流动相中甲醇与水相的体积比，最小的是水相中乙酸的体积分数.以分离度为评价指标，得到的优化方案是A1B4C1D4;以分析时间为评价指标，得到的优化方案是A4B3C2D1.

表3 正交试验设计实验结果分析

由于按不同的评价指标得到的优化方案不一致，而一个好的HPLC方法，不仅要有足够的分离度，还应该有较短的分析时间，因此我们研究了各因素在不同水平下的分离度与分析时间的相关性，得到了如图1所示的分离度与分析时间的关联图(1，2，3和4分别对应每个因素的4个水平).据图1的结果，在保证有效分离的前提下兼顾分析时间，综合分析影响熊果酸和齐墩果酸分离效果的因素后，最终选定的优化方案是:A3B3C1D2，即流动相中甲醇与水相的体积比为90∶10，水相中乙酸和三乙胺的体积分数分别为0.5%和0.01%，流动相流速为0.8 mL/min，该方案对应表2中的11号实验.可见，在此色谱条件下，熊果酸和齐墩果酸在16 min内得到了有效分离，分离度达到了1.425.

2.2 方法的工作曲线与精密度

在上述优化得到的色谱条件(色谱柱:Waters C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:体积比为90∶10的甲醇与含有0.5%乙酸和0.01%三乙胺的水相混合溶剂;流速:0.8 mL/min;检测波长:210 nm;进样量:10 μL;柱温:25℃，测定一系列不同质量浓度的齐墩果酸与熊果酸混合标准溶液的色谱峰面积，以峰面积A对各组分的质量浓度ρ绘制了工作曲线，得到齐墩果酸和熊果酸工作曲线的线性范围分别为2.5～340.0 μg/mL与5.0～340.0 μg/mL，线性回归方程分别为A=4 736.2 ρ/－5 878.4(r=0.998 9)与A=3 659.2 ρ/－17974.3(r=0.999 6).在相同条件下对质量浓度均为100.0 μg/mL的齐墩果酸与熊果酸混合标准溶液重复进样11次，测得齐墩果酸的保留时间tR和峰面积A的相对标准偏差分别为1.21%和1.15%，熊果酸的保留时间tR和峰面积A的相对标准偏差分别为1.01%和0.98%.以3倍信噪比(S/N=3)确定了齐墩果酸与熊果酸的最低检出限(LOD)分别为1.15 μg/mL和2.25 μg/mL.

2.3 女贞子和山楂中齐墩果酸和熊果酸的含量测定

将女贞子提取液和山楂提取液用0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤后，在选定的色谱条件进样分析，样品的色谱图见图2，图中谱峰的定性识别采用标准加入法.样品中齐墩果酸与熊果酸的含量测定结果和加标回收率测定结果从表4可见，在选定的色谱条件下，女贞子和山楂中的齐墩果酸与熊果酸彼此之间以及它们与样品中的其它共存组分之间都得到了有效分离，而且定量测定的相对标准偏差和加标回收率都满足要求，说明通过正交试验设计优化建立的此HPLC方法可以用于女贞子和山楂中齐墩果酸与熊果酸的分离分析.

表4 女贞子和山楂中齐墩果酸和熊果酸的含量(n=5)%

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(责任编辑王琳)

Study on the Conditions of HPLC Method for the Separation and Determination of Oleanolic and Ursolic Acid in the Orthogonal Experiment

LU Gui-ying，SUN He-lue，YANG Xue-ying，HU Xu-fang，MA Zhi-gang，CAO Qiu-e
(Key Laboratory of Medicinal Chemistry for Natural Resources，Ministry of Education，School of Chemical Science and Technology，Yunnan University，Kunming 650091，China)

To develop a rapid and convenient method for the separation and determination of oleanolic acid(OA) and ursolic acid(UA)by HPLC，the main factors influencing HPLC，including the volumetric ratio of methanol and aqueous phase in the mobile phase，the percent of acetic acid and triethylamine in the aqueous phase，and the flow rate of the mobile phase，were optimized with the L16(44)orthogonal experimental design table.Ursolic acid and oleanolic acid could be separated and determined effectively within 15 min when a mixture of MeOH and aqueous solution consisting of 0.5%acetic acid and 0.01%triethylamine with the volumetric ratio of 90∶10 was employed as the mobile phase with a flow rate of 0.8 mL/min.The linear ranges were 2.5—340.0 μg/mL for oleanolic acid and 5.0—340.0 μg/mL for ursolic acid with good correlation.The method was applied satisfactorily for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in Ligustrum lucidum Ait.and hawthorn with the relative standard deviation less than 2.0%，and the recovery rate ranging from 95%to 105%.

orthogonal experimental design;HPLC;oleanolic acid;ursolic acid

O 657.7

A

1672－8513(2012)04－0239－04

10.3969/j.issn.1672－8513.2012.04.002

2012－03－13.

云南省自然科学基金(2008CD066).

卢桂英(1981－)，女，硕士研究生，工程师.主要研究方向:色谱分析与柱材料研究.

曹秋娥(1967－)，女，博士，教授，博士生导师.主要研究方向:光谱、色谱与分离材料.