适于肝干细胞培养的壳聚糖－硫酸肝素－透明质酸复合支架①

雷菠，曲鑫建，李韬，孔保庆，莫颂轶，王凤永

（1.右江民族医学院基础学院，广西 百色 533000 E－mail：qxjnm312＠yahoo.com.cn；2.大连理工大学干细胞与组织工程研发中心，辽宁 大连 116024）

近年来，广西地方性肝脏疾病流行广泛，严重影响当地居民健康［1，2］。随着肝脏病治疗技术的发展，细胞移植治疗备受关注，利用干细胞再生医学的“人工肝脏”修复功能缺失的组织器官成为技术要点［3，4］。肝组织工程就是利用三维支架、种子细胞在适宜的环境中构建体外可移植的肝脏替代组织，以求解决治疗肝脏疾病这一难题［5～7］。壳聚糖（chitosan，C）、硫酸肝素（heparin sulfate，HS）和透明质酸（hyaluronate，Ha）是具有很好的生物相容性的药用天然材料［8～10］。已有研究通过对C的改性，构建与其他材料的复合支架等进行临床应用，但是此类支架的性能存在着不同的缺陷，如孔的贯穿性不大，支架与细胞的黏附率不高等［11，12］。复合生物材料加入Ha，则孔的贯穿性较好，细胞在支架上分布均匀［13，14］；复合支架中若有 Hs，则利于肝前体细胞生长［15］。笔者研究一种新型C－HS－Ha复合支架，并探索此支架与肝干细胞（hepatic stem cells，HSCs）共培养模型，用于体外构建适合细胞生长增殖和细胞黏附作为三维支架材料3D模型，为用于肝组织工程和药物筛选奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料 表皮生长因子（EGF），胰岛素（insulin），胶原酶（Sigma），溶 菌 酶 （Sigma）DMEM／F12 粉 （Gibco），Hoechst33342（Sigma），CCK－8Kit（日本同仁化学研究所。C（90%的脱乙酰度）、HS和Ha购于上海伯奥生物科技有限公司。2－吗啉乙烷磺酸 （MES），碳化二亚胺（EDAC），N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）购于北京恒业中远化工有限公司。

冷冻干燥机（德国GT2－9）；倒置相差显微镜（OLYMPUS IX70）；扫描电子显微镜（日立公司S2520）；酶标仪（Thermo Labsystems MK3）。

1.2 实验方法

1.2.1 支架材料的制备 在60℃水浴下，将 HS、Ha各以0.036%（W／V）一起溶于水，作为原液1；将C溶于2%（V／V）的乙酸溶液制得百分含量为1.8%（W／V）的原液2，进行离心、除渣和脱泡。将原液1∶原液2以体积比为3∶7、4∶6、5∶5混合后，高速旋转震荡，使成分混匀充分，静置除泡。取96孔板，每孔注入200ml混合液，预冻4h（－80℃冰箱），冷冻干燥24h，支架成型。随后进行交联支架，将支架浸入含50mmol／L MES、50mmol／L EDAC、50mmol／L NHS的40%（V／V）乙醇试剂中，室温交联6h。将交联剂去除，为中和残留乙酸，再加入0.1mol／L Na2HPO4（pH＝7.4）室温孵育2h；用乙醇40%（V／V）清洗4次，每次30min，经双蒸水反复冲洗至pH值为7.0左右，再次冷冻干燥，即得C－HS－Ha复合3D支架（以不加Ha和HS制备的C复合支架作为对照组）。相差显微镜下观察，选择结构均一的支架，修剪成可适宜放置培养器中大小形状，消毒备用。

1.2.2 吸水率、降解率、支架孔径和孔隙率的测定 ①吸水率：设支架干态时的质量为（W0），室温下浸泡于三蒸水中24h后支架的质量为（W1），分析天平称量。则支架材料吸水率为：②降解速率：将C－HS－Ha支架放置在含有溶菌酶1×105u，胶原酶的磷酸盐缓冲液（PBS）的试管内，置于37℃水浴6周，每隔1周取出支架，蒸馏水洗后冷冻干燥并称重（W）。支架材料降解率为：d（%）③平t均孔径：将支架C－HS－Ha真空喷金后，扫描电镜下观察支架表面形态学结构。在支架的内部选取4个不同的视野，每个视野下测量10个孔径值，计算支架的平均孔径。④孔隙率：设C－HS－Ha支架材料的质量（Ms），盛满乙醇的比重瓶质量（M1），乙醇充分充盈于支架材料孔隙并加满乙醇后的质量（M2），取出支架材料后的剩余乙醇与比重瓶质量（M3），分别用分析天平称量。材料孔隙率为：ε（%）＝

1.2.3 HSCs分离培养 新鲜分离细胞用F12／DMEM培养液悬浮，计数后以一定密度接种在6孔和24孔培养板中。F12／DMEM 培养液含10%FCS 、100u／ml青霉素 G、100μg／ml链霉素、5μg／ml胰岛素（insulin）、各种生长因子等，于CO2培养箱37℃培养。一般待细胞增殖80%瓶底面积时对其传代。

1.2.4 HSCs的种植和3D培养 复合支架（直径0.5cm，高0.4cm）浸泡在基础培养基（DMEM∶F12＝1∶1）中12h，除去支架表面水分，放置于另一个孔板（ⅰ号）中。酶解消化肝干细胞并调整细胞的浓度（c）为每5×105cells／ml，取10μl体积（v）的细胞接种到支架上。将细胞与支架复合物置于37℃、5%的CO2培养箱内孵育0.5h，待细胞贴壁后，向ⅰ号板补加新鲜含10%胎牛血清的完全培养基。4h后将支架移至24孔板，并向24孔板补加完全培养基，计算ⅰ号板溶液中未黏附的细胞总数a1。则细胞实际上架总数为c×v－a1。按下式计算黏附率：黏

1.2.5 细胞与支架复合物的扫描电镜观察 收集培养6天的复合支架上的细胞，PBS洗涤细胞3次，室温下用2.5%戊二醛固定2h，PBS洗涤细胞3次；室温下1%锇酸固定2h，PBS洗涤细胞2次；用乙醇分别以浓度为30%、50%、70%、80%、90%、100%系列脱水各20min。然后包埋切片喷金，电镜下观察。

1.2.6 细胞增殖检测 以浓度为5×105cells／ml的HSCs，取10μl分别接种于每个C－HS－Ha复合支架组和C复合支架组中，同时以浓度为5×105cells／ml的 HSCs，体积100μl接种于96孔板培养（二维悬浮培养对照组），每组3个重复。应用CCK－8试剂分别在第1周内每天用酶标仪检测。

2 结果

2.1 扫描电镜观察空支架 电镜照片显示冻干后的C－HS－Ha复合材料呈纤维状排列并有大小不等的隆起，其表面粗糙，呈乳白色；材料内部有较多的孔隙，各孔隙相互贯穿，孔较均匀，呈海绵状多孔隙结构；孔壁厚约2.5μm（见图1）。支架孔的结构与原料的体积比有关，壳聚糖与明胶体积比为3∶7的复合支架最为疏松，5∶5的支架最致密。

3.2 支架孔径、孔隙率、吸水率及黏附率的测定 C－HSHa复合支架的孔径大部分分布在90～100μm之间，孔隙率均大于80%；孔径和空隙率随着C与G比例的增大而减小；当壳聚糖与明胶质量百分含量相同配比时（C∶0.9%，G∶0.9%），C－HS－Ha复合支架与C－G复合支架相比较，两者孔径和孔隙率相差不大，但前者的黏附率比后者增大约1.0倍，高达70.1% （见表1）。

2.3 扫描电镜观察空支架及HSCs在支架上的生长状态HSCs接种到C－HS－Ha复合支架内培养至第7天，可见细胞在支架孔壁上进行贴壁生长且相互连接（见图2A）；在孔隙间通过细胞连接的细胞群体（见图2B）形成网络样结构，使得不同孔之间的HSCs相互联系形成上皮样结构。继续培养1周，细胞团簇紧密（见图2C），覆盖在支架表面与空隙之间，可见到大量增殖细胞。

图1 扫描电镜观察C－HS－Ha复合支架两原液（C和D）体积比：3∶7（A），4∶6（B），5∶5（C）

图2 扫描电镜下HSCs在C－HS－Ha复合支架内的生长状态

2.4 支架降解率的测定 C－HS－Ha复合支架在体外能降解，第1周降解约10%；在6周的降解测试中，前4周降解较快，之后降解较慢，到第6周降解趋于平缓，降解率达到30%左右。

2.5 HSCs在支架内生长增殖的检测 将等量的HSCs注入C－HS－Ha复合支架和C－G复合支架，由于支架不同，细胞的黏附率也不同，第1天所测的吸光度值不同，C－HS－Ha的吸光度值约为C－G的2倍（见图4）。从结果来看，在C－HS－Ha和C－G支架和二维环境中培养，HSCs生长曲线都呈S型，由于各种环境的情况有所不同而有所差别。细胞在3D下C－HS－Ha和C－G复合支架与二维96孔板培养，达到最高数量值的时间分别为第6天、第5天、第4天，随后细胞生长都进入生长平台期；在C－HS－Ha复合支架组中，由于C与G体积比不同，其增殖倍数也不同，体积比3∶7、4∶6、5∶5的细胞增殖倍数分别为11.3、11.2、10.3；C－G支架和二维悬浮培养的细胞增殖倍数分别约7.8倍和3.0倍（见图4）。

图3 C－HS－Ha复合支架的体外降解率

3 讨论

在干细胞与组织工程中，利用种子细胞、支架材料和生长因子在体外构建的类似三维功能环境是研究重点。作为组织工程支架的材料要求具备以下条件：无免疫源性，生物相容性良好；生理环境材料可降解和具有疏松多孔结构；可塑性和一定的力学支撑强度，利于细胞黏附和增殖［16，17］。由于C－G支架的细胞黏附率不高、孔的贯穿性不好、细胞分布均一性差，因而为了提高其黏附率、孔的贯穿性及细胞的分布均一性，我们制造了一种新支架C－HS－Ha复合支架材料，并将HSCs接种至此新支架中培养，进而考察细胞黏附及细胞的生长增殖等情况。

采用冷冻干燥法制备的C－HS－Ha复合支架孔隙均匀、孔的贯穿性较好且比表面大，又具有一定的机械强度，可维持支架的基本形状8周时间，从而对细胞起到有效的支撑作用；该支架能够降解，其降解产物对细胞无毒害作用，最重要的是HSCs接种到C－HS－Ha复合支架与C－G复合支架相比较，前者的细胞黏附率高达80%，约为后者的2倍；细胞分布比后者更均匀。这可能与以下因素有关。其一，通过调节支架表面的亲水性和表面电荷而促进细胞的黏附。三种材料除含有羟基外，C含有氨基；HS含有磺酸基；而Ha含有羧基。复合支架从成分上看增加了羟基、磺酸基、羧基官能团进而调节了支架表面的亲水性和表面电荷，有助于促进细胞粘附以及材料的生物相容性。其二，Ha可结合大量水的性质使支架的吸水率增大。有报道证实Ha在体内具有调节渗透压及细胞迁移等生理功能［18，19］。在Ha的作用下，细胞在支架上可进行生理迁移活动，避免了平面培养的接触抑制现象发生，有利于在支架内的细胞均匀生长分布；当Ha比例降解时，支架所提供的生长空间促使细胞形成团块状生长。其三，从支架结构上看，选择合适的条件如原料种类、原料浓度、各成分比例及冷冻干燥条件等可以制备不同的支架结构，本支架材料的孔径、孔隙率等都较理想，且孔的贯穿性较好，这些有利于细胞的生长。通过检测HSCs在C－HS－Ha复合支架内的生长增殖状态可知，细胞在支架内增殖约11倍，是C－G复合支架的1.4倍，是二维培养的3.7倍。电镜图片显示，HSCs形成了网络样结构生长并有类似组织样结构，说明C－HS－Ha比C－G复合支架更适合HSCs的生长增殖。制备的HSCs在C－HS－Ha支架上培养方式构成了模拟体内3D培养环境，其比表面积增加并且生长空间更大，因此，在培养器中可以一次性多添加培养基不用频繁更换，有利于细胞生长增殖。在正常生理环境上，细胞外基质是由胶原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖等生物大分子所组成，这些分子相互交联成复杂功能的网状结构。本实验所选择的三种材料：C、HS和Ha都属于生物相容性良好的天然生物性材料，与细胞外基质成分相关。C是多糖物质，HS是蛋白聚糖类，Ha也是高分子多糖，应用此三种原料合成支架，其成分类似于细胞外基质成分，构成了对细胞生长有利的环境。另外，C－HS－Ha复合支架中含有HS以其可富集环境中的生长因子的作用［20］，有利于细胞按自身信号来调节营养因子的释放，更好地促进HSCs的生长增殖等。Ha的作用使细胞分布均匀，从而提高了支架的空间利用率，因此更利于细胞的生长增殖。

图4 HSCs的标准曲线和HS／Cs在C－HS－Ha复合支架内的生长状态

理想的组织工程三维支架应该模拟体内细胞生存的微环境，诱导细胞与此微环境密切接触，并使细胞与材料很好地黏附，并最终在其上伸展与增殖，制备的C－HS－Ha复合支架，就是以此理念构建的具有良好细胞相容性的复合支架。从整体上看，本研究所构建的C－HS－Ha支架材料具备与细胞外基质结构和功能相似的特点，能很好地维持细胞黏附、生长、增殖，可作为HSCs的理想三维支架材料。

表1 复合支架的孔径、孔隙率、吸水率、细胞黏附率

［1］ 盛治国，郭家彬，彭双清.体外细胞三维培养技术在药理毒理学研究中的应用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2007，21（5）：444－448.

［2］ Li Z，Leunq M，Hopper R，et al.Feeder－free self－renewal of human embryonic stem cells in 3Dporous natural polymer scaffolds［J］.Biomaterials，2010，31（3）：404－412.

［3］ Irons HR，Cullen DK，Shapiro NP，et al.Three－dimensional neural constructs：a novel platform for neurophysiological investigation［J］.J Neural Eng，2008，5（3）：333－341.

［4］ Tan H，Chuc R，Payne KA，et al.Injectable in situ forming biodegradable chitosan－hyaluronic acid based hydrogels for cartilage tissue engineering［J］.Biomaterials，2009，30（13）：2499－2506.

［5］ He J，Li D，Liu Y.Fabrication and characterization of chitosan／gelatin porous scaffolds with predefined internal microstructures ［J］.Polymer，2007，48（13）：4578－4588.

［6］ Zehe C，Engling A，Wegehingel S，et al.Cell－surface heparan sulfate proteoglycans are essential components of the unconventional export machinery of FGF－2［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（42）：15479－15484.

［7］ Mao JS，Zhao LG，Yin YJ，et al.Structure and properties of bilayer chitosan－gelatin scaffolds［J］.Biomaterials，2003，24 （6）：1067－1074.

［8］ Marcos GF，Anne JM，Monika H，et al.Silk fibroin／hyaluronan scaffold for human mesenchymal［J］.Biomaterials，2009，30（28）：5068－5076.

［9］ Seidlits SK，Khaing ZZ，Petersen RR，et al.The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation ［J］.Biomaterials，2010，31（14）：3930－3940.

［10］ 刘巨超，赵云山，刘广民，等.肝组织工程支架评价方法研究［J］.医疗卫生装备，2009，30（7）：12－13，1.

［11］ 亚雄，李涤尘，赵倩，等.肝细胞体外培养平台的仿生设计与构建［J］.中国生物医学工程学报，2010，29（6）：889－893.

［12］ 杨照，申少波，刘文晶，等.蚕丝蛋白和明胶复合组织工程材料的组织相容性研究［J］.华南国防医学杂志，2011，25（1）：44－47.

［13］ 赵倩，刘亚雄，高琨，等.肝组织工程支架的仿生设计与有限元分析［J］.西安交通大学学报，2011，45（8）：108－112.

［14］ 郝星，贺健康，高琨，等.蚕丝蛋白／明胶多孔肝组织支架的制备及性能研究［J］.西安交通大学学报，2011，45（11）：121－126.

［15］ 万涛，刘利.肝组织工程的影响因素［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11（6）：1137－1140.

［16］ 康玉占，汪艳，高毅.脱细胞化肝脏生物衍生支架的制备及鉴定［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（8）：1505－1508.

［17］ Li K，Qu X，Wang Y，et al.Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers［J］.Journal of Biomedical Materials Research：Part A，2005，75A （2）：268－274.

［18］ Liu H，Fan H，Wang Y，et al.The interaction between a combined knitted silk scaffold and microporous silk sponge with human mesenchymal stem cells for ligament tissue engineering［J］.Biomaterials，2008，29（6）：662－674.

［19］ Lu Q，Zhang X，Hu X，et al.Green process to prepare silk fibroin／gelatin biomaterial scaffolds［J］.Martomolecular Bioscience，2010，10（3）：289－298.

［20］ Tiyaboonchai W，Chomchalao P，Pongcharoen S，et al.Preparation and characterization of blended bombyx mori silk fibroin scaffolds［J］.Fibers and Polymers，2011，12（3）：324－333.