HPLC-PAD法同时测定精制银翘解毒胶囊中对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷的含量

仇其原，邓晓文，姚立娟

江苏省盐城药品检验所，盐城224001

HPLC-PAD法同时测定精制银翘解毒胶囊中对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷的含量

仇其原，邓晓文，姚立娟

江苏省盐城药品检验所，盐城224001

目的：采用HPLC-PAD法同时测定精制银翘解毒胶囊中对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷的含量。方法：色谱柱：Capcell Pak C18（150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水（含0.25%的冰醋酸）梯度洗脱；检测波长：300 nm和228 nm；流速：1m L·m in-1；柱温：30℃。结果：对乙酰氨基酚测定的线性范围28.15～84.45μg（r=0.9999），平均含量为235.06mg·g-1，RSD为0.17%；绿原酸测定的线性范围0.2048～0.6144μg（r=0.9998），平均含量为1.91mg·g-1，RSD为0.21%；连翘苷测定的线性范围0.1054～0.3162μg（r=0.9994），平均含量为1.00mg·g-1，RSD为0.32%；牛蒡苷测定的线性范围1.044～3.132μg（r=0.9998），平均含量为7.04mg·g-1，RSD为0.16%。结论：该法简便、灵敏、准确，适用于精制银翘解毒胶囊的质量控制。

精制银翘解毒胶囊；对乙酰氨基酚；绿原酸；连翘苷；牛蒡苷；高效液相色谱法

精制银翘解毒胶囊处方由牛蒡子、金银花、甘草、连翘等10味中药和对乙酰氨基酚组成，具有清热散风、解毒退烧的功效。临床上用于治疗扁桃体炎、咽炎、上呼吸道感染等病症。精制银翘解毒胶囊目前使用的质量标准为国家标准[WS3-99（X-69）-99（Z）]。该标准含量测定项是用紫外分光光度法[1]仅对对乙酰氨基酚的含量进行了测定；该法操作繁琐，干扰因素多，容易引起误差。目前文献报道对乙酰氨基酚含量测定方法有TLCS法[2]、永停滴定法[3]、GC法[4]、HPLC法[5]等；而处方中同样具有重要疗效的中药如金银花的有效成分绿原酸、连翘的有效成分连翘苷、牛蒡子的有效成分牛蒡苷等均未做定量检测。

本文运用HPLC-PAD法[6]同时对对乙酰氨基酚[7]、绿原酸[8]、连翘苷和牛蒡苷4种成分含量进行检测；该法专属性高、重复性好、操作简便、结果准确；本法似可作为精制银翘解毒胶囊的含量测定方法，以更好地对该产品进行质量监控。

1 材料

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪、Waters2996二极管阵列紫外检测器（PAD）、Empower色谱工作站（美国waters公司）；XS205 DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药

对照品：对乙酰氨基酚（批号100018～200408）、绿原酸（批号110753～200413）、连翘苷（批号110821～200711）、牛蒡苷（批号110819～201007）均购自中国药品生物制品检定所。

供试品：精制银翘解毒胶囊（贵州恒和制药有限公司，批号110205、111101）；甲醇、乙腈（色谱纯）；水（纯化水）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 不同流动相条件的考察吸取供试品溶液进样分析，分别以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%冰醋酸、乙腈-0.25%冰醋酸[9]等不同浓度、不同比例的流动相系统进行等度和梯度洗脱实验，比较不同流动相系统以及不同梯度洗脱条件的色谱图，选择分离效果最好，时间尽可能短的最佳流动相条件。

2.1.2 检测波长的选择通过PAD检测器，对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷4种成分色谱峰于200～400 nm[10]波长扫描，选择合适波长进行实验。结果选择300 nm作为对乙酰氨基酚和绿原酸的检测波长；228 nm作为牛蒡苷和连翘苷的检测波长。

2.1.3 色谱条件最终选择的色谱条件：色谱柱为Capcell Pak C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-水-冰醋酸，按表1进行梯度洗脱；检测波长为300 nm和228 nm；流速为1mL·min-1；柱温为30℃；进样量为20μL。理论塔板数按对乙酰氨基酚峰计不低于4000。

表1 乙腈-水（含冰醋酸0.25%）流动相梯度洗脱比例

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液取对乙酰氨基酚28.15mg，置于10mL量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度，摇匀得每1mL含2.815mg对乙酰氨基酚的对照品溶液。另取绿原酸对照品10.24mg，置于100mL量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度，摇匀；另取2mL绿原酸溶液置10mL量瓶中，定容至刻度，制得每l mL含0.02048mg绿原酸的对照品溶液。另取连翘苷对照品10.54mg，置于100mL量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度，摇匀；另取5mL连翘苷溶液置50mL量瓶中，定容至刻度，制得每lmL含0.01054mg连翘苷的对照品溶液。另取牛蒡苷对照品10.44mg，置于100mL量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，制得每lmL含牛蒡苷0.1044 mg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取精制银翘解毒胶囊10粒，精密称定，内容物研细后，称取0.5956 g，置于50 mL的量瓶中，加50%的甲醇40mL，浸渍约30min，超声处理30min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得[11]。

2.2.3 空白对照溶液分别按缺少对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷的处方比例进行配制，方法见“2.2.2”项下，得到空白对照溶液。分别绘制两个波长的空白对照图谱，见图1。

图1 空白对照图谱（A）300 nm；（B）228 nm

2.3 系统适应性试验

按所给色谱条件将对照品溶液、阴性对照品、供试品溶液分别进样20μL，测定峰面积并记录色谱图，结果供试品色谱峰（见图2、图4）中，在各对照品色谱峰（见图3、图5）的相应位置上有保留时间相同的色谱峰；并且阴性样品（见图1）在与对照品色谱峰相应的位置上无对应的色谱峰出现，阴性样品对测定结果无干扰。对乙酰氨基酚峰、绿原酸峰、连翘苷峰和牛蒡苷峰的理论塔板数均高于4000，分离度大于2.0，符合要求。

图2 供试品在228 nm处色谱图峰3为连翘苷；峰4为牛蒡苷

图3 对照品在228 nm处色谱图峰3为连翘苷；峰4为牛蒡苷

图4 供试品在300 nm处色谱图峰1为对乙酰氨基酚；峰2为绿原酸

图5 对照品在300 nm处色谱图峰1为对乙酰氨基酚；峰2为绿原酸

2.4 线性关系的考察

取对照品储备液，按上述色谱条件分别进样10、15、20、25、30μL测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，对乙酰氨基酚的回归方程为：Y=1.492×105X-1.191×104，r= 0.9999，线性范围在28.15～84.45μg，呈良好线性关系；绿原酸的回归方程为：Y=2.179X×106-1.191× 104，r=0.9998，线性范围在0.2048～0.6144μg，呈良好线性关系；连翘苷的回归方程为：Y=5.085X×105-1.293×105，r=0.9994，线性范围在0.1054～0.3162μg，呈良好线性关系；牛蒡苷的回归方程为：Y=1.526X× 106-6.118×105，r=0.9998，线性范围在1.044～3.132 μg，呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取各对照品溶液，进样量为10μL，分别连续进样5次，测定峰面积，结果对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷峰面积的RSD分别为0.27%、0.21%、0.32%和0.36%。表明精确度良好。

2.6 重复性试验

取同一供试品溶液连续5次进样，测定该份样品中对乙酰氨基酚平均含量为235.06mg·g-1，RSD为0.68%；绿原酸平均含量为1.91mg·g-1，RSD为0.72%；连翘苷平均含量为1.00 mg·g-1，RSD为0.48%；牛蒡苷平均含量为7.04 mg·g-1，RSD为0.76%。表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取样品（批号：111101）内容物1份，按照“2.2.2”项下配制供试品方法操作，按照“2.1”色谱条件分析，分别在0、4、12、24、48 h测定，结果5次所得的对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷峰面积值的RSD均小于2%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取样品（批号：111101）内容物9份[12]，每份约0.28 g，精密称定，分别置于50mL量瓶中。由平均装量和样品测定项下所得含量（mg/粒）计算对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷的含量（mg），每份各加入一定量的对照品，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤，进样20μL，按外标法计算9份溶液中对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷和牛蒡苷的量，结果见表2。

2.9 样品测定

取样品（批号：111101）20粒，称得平均装量，将内容物混匀，研细，称取约0.6 g，置于50mL量瓶中，加50%的甲醇40mL，浸渍约30min，超声处理30min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液，进样20μL，按外标法以峰面积计算样品中对乙酰氨基酚、绿原酸、连翘苷及牛蒡苷的含量（mg/粒），同法测定另外一批的含量，结果见表3。

表2 各成分加样回收率试验

表3 样品含量测定结果（mg·g-1）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 波长的选择选择波长为228 nm和300 nm。通过各对照品溶液在200～400 nm处进行紫外光谱扫描检测显示，对乙酰氨基酚最大吸收波长为245 nm，绿原酸最大吸收波长为326 nm，连翘苷最大吸收波长为228 nm，牛蒡苷最大吸收波长为227 nm。在300 nm处，对乙酰氨基酚和绿原酸均有吸收，且线性关系良好，兼顾各组分的检测信号强度和检测灵敏度，故选择300 nm作为检测波长；牛蒡苷和连翘苷在228 nm附近处均有最大吸收，故选择228 nm作为检测波长。

3.1.2 流动相的考察精制银翘解毒胶囊组成复杂，其中各种活性成分的化学性质差异较大。本实验在设计过程中分别考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%冰醋酸、乙腈-0.25%冰醋酸等不同浓度、不同比例的流动相系统，进行等度和梯度洗脱实验，比较不同流动相系统以及不同梯度洗脱条件的色谱图，选择分离效果最好、时间尽可能短的最佳流动相条件。而采用乙腈-0.25%冰醋酸作流动相，进行梯度洗脱可将4个组分完全分离。

3.2 供试品溶液提取条件的考察

3.2.1 提取时间的优化在超声提取时，比较了15、30、45、60min含量测定结果，结果表明，提取时间30、45、60min时，各组分峰面积不随时间延长而有所增加，故超声处理时间选用30min。

3.2.2 提取溶剂的选择取供试品（批号：111101）研细后精密称取约0.6 g，分别以有机溶剂甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇为溶剂，对乙酰氨基酚等4种成分含量测定分析，实验表明，提取溶剂为50%甲醇时，提取效率最高，故选择其作为提取溶剂。

3.2.3 提取方式的选择取供试品（批号：111101）研细后精密称取约0.6 g，精密加入50%甲醇20 mL，称定重量，分别采用超声处理和热回流的方式提取60min，测定供试品中各组分含量。实验表明，采用超声处理与加热回流的结果一致，对实验无影响，而超声处理更加简单易行，故选择超声处理。

3.3 色谱柱的考察

分别采用Capcell Pak C18色谱柱（150mm×4.6 mm，5μm）、Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）和Waters2695高效液相色谱仪，测定样品中对乙酰氨基酚等成分的含量，长柱分离效果好，适合多种成分中药分离，但出峰时间相对较长；短柱出峰时间短且主峰理论板数和分离度均符合要求，故选择Capcell Pak C18色谱柱（150mm×4.6mm，5 μm）作为色谱柱。

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Simultaneous Quantitative Determ ination of Paracetamol,Chlorogenic Acid, Forsythin and Arctinin in Jingzhi Yinqiao Jiedu Capsules by HPLC-PAD

QIU Qi-yuan,DENG Xiao-wen,YAO Li-juan
Yancheng Institute of Pharmaceutical Control,Yancheng 224001,China

Objective:To establish an HPLC method for the determination of paracetamol,chlorogenic acid,forsythin and arctinin in Jingzhi Yinqiao Jiedu capsules.Methods:The column was Capcell Pak C18(150mm×4.6mm,5μm);Acetonitrile-water(It contained 0.25%glacial acetic acid)constituted the mobile phase for gradient elution;The wavelengths for detection were 300 nm and 228 nm;The flow rate was at 1 mL·min-1;The column temperature was at 30℃.Results:For paracetamol,the linear range was 28.15～84.45μg(r=0.9999),the average content was 235.06mg·g-1and the Relative Standard Deviation(RSD)was 0.17%;For chlorogenic acid,the linear range was 0.2048～0.6144μg(r=0.9998),the average content was 1.91mg·g-1and the RSD was 0.21%;For forsythin,the linear range was 0.1054～0.3162μg(r=0.9994),the average content was 1.00mg·g-1and the RSD was 0.32%;For arctinin,the linear range was 1.044～3.132 μg(r=0.9998),the average content was 7.04mg·g-1and the RSD was 0.16%.Conclusion:This method is accurate,simple and reproducible for quantitative analysis of Jingzhi Yinqiao Jiedu capsules.

Jingzhi Yinqiao Jiedu capsules;Paracetamol;Chlorogenic acid;Forsythin;Arctinin;HPLC

R927.2

A

1673-7806（2012）05-402-04

仇其原，男，主管药师E-mail:gita_80@126.com

2012-06-15

2012-07-25