雪荔组方水提醇沉液的HPLC指纹图谱研究*

胡巍，陈明磊，方芸⋆⋆

雪荔组方水提醇沉液的HPLC指纹图谱研究*

胡巍1，陈明磊2，方芸1⋆⋆

1南京大学医学院附属鼓楼医院临床药学室，南京210008；2南京中医药大学，南京210046

采用HPLC建立雪荔组方的指纹图谱，以Agilent HC-C18柱，乙腈-冰醋酸为流动相进行梯度洗脱，流速为0.8m L·m in-1，检测波长为335 nm。根据10批供试品指纹图谱，确定了14个共有峰，相似度均大于0.95。

雪荔组方；指纹图谱；高效液相色谱法

雪荔组方由荔枝草、车前草、六月雪、紫花地丁等4味中药组成，具有清热解毒、利尿消肿等功效，临床常用于治疗尿路感染[1]。组方中药含有黄酮、环烯醚萜苷等多种化学成分。现代研究证明，荔枝草等具有显著的抑菌[2]、抗炎[3]等作用。现采用指纹图谱技术用于雪荔组方的质量控制。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器（DAD）、Agilent chemstation工作站（美国安捷伦公司）。

1.2 试药

高车前苷对照品（纯度＞98%，批号：20120128，上海医药工业研究院）；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

荔枝草等中药材购自南京中药饮片厂，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定：荔枝草为唇形科植物荔枝草（Salvia plebeia R.Br）的全草；车前草为车前科植物车前（Plantago asiatica L.）的全草；六月雪为茜草科植物六月雪[Serissa serissoides（DC.）Druce]的全株；紫花地丁为堇菜科植物光瓣堇菜（Vida philippice Cav.）的全草。

10批雪荔组方水提醇沉液为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

按质量比2∶2∶2∶1称取荔枝草、车前草、六月雪、

紫花地丁共100 g，加入10倍量水加热回流提取2次，每次2 h，合并滤液，浓缩至相对密度为1.01的清液，加入乙醇使含醇量达60%，静置72 h，浓缩滤液并准确定容至200mL，配制成质量浓度为0.5 g· mL-1的水提醇沉液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取高车前苷20.2mg，置于100mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成浓度为0.202 g·L-1对照品储备液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Agilent HC-C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相为0.5%（V/V）冰醋酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱（0～10min，10%～15%B；10～18 min，15%～18%B；18～25 min，18%～20%B；25～30 min，20%～22%B；30～40 min，22%～40%B；40～55 min，40%～60%B）；检测波长为335 nm；柱温为30℃；流速为0.8mL·min-1。

2.4 指纹图谱的方法学考察

2.4.1 精密度试验取同一份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，以高车前苷色谱峰（图1～2中第12号峰）作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰的相对保留时间的RSD在0.06%～0.23%之间，相对峰面积RSD在0.90%～2.94%之间，均小于3%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性试验取同一份供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24 h取样，按“2.3”项下色谱条件进样，以高车前苷色谱峰（图1～2中第12号峰）作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD在0.97%～1.03%之间，相对峰面积的RSD在1.32%～2.86%之间，均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验按“2.1”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.3”项下色谱条件进样，以高车前苷色谱峰（图1～2中第12号峰）作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，供试品各共有峰的相对保留时间的RSD在0.46%～1.40%之间；相对峰面积的RSD在1.34%～2.64%之间，表明供试品溶液制备方法的重复性良好。

2.5 指纹图谱结果及分析

2.5.1 雪荔组方水提醇沉液指纹图谱的建立取不同批号的药材，配制10份雪荔组方，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取20μL进样，将色谱图导入“中药色谱图分析和数据管理系统”软件，匹配时间漂移值设为0.2，并自动匹配，生成对照谱图（R）及供试品的指纹图谱，见图1、图2。

图2 10批供试品溶液的对照谱图

图3 高车前苷对照品溶液色谱图

2.5.2 雪荔组方水提醇沉液指纹图谱技术参数通过对10批供试品溶液色谱图的分析，最终确定共有峰14个。高车前苷为主要成分之一，将其对照品溶液按照“2.3”项下色谱条件进样分析，与供试品溶液色谱图进行比对，相对保留时间一致的峰为12号峰（见图3），故选择其作为参照峰（S），设定其保留时间和峰面积值均为1.0，计算余下各峰的相对保留时间和相对峰面积，见表1、表2。经计算，10批供试品中高车前苷含量分别为0.821、0.823、0.818、0.835、0.806、0.829、0.831、0.816、0.826、0.822 mg·g-1，平均含量为0.822mg·g-1，RSD为1.01%。

表1 共有峰的相对保留时间

2.5.3 相似度分析用“中药色谱图分析和数据管理系统”软件对10批供试品溶液的色谱图进行相似度评价，结果10批供试品溶液与生成的对照图谱进行比较，相似度均大于0.95，见表3。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

利用DAD检测器对190～400 nm波段进行扫描并采集三维扫描图，综合考虑设定波长内峰的数目、色谱峰的分离情况，最终选择335 nm作为检测波长。

表2 共有峰的相对峰面积

表3 10批供试品图谱的相似度结果

3.2 流动相的选择

本实验先后考察了甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水、乙腈-水-冰醋酸等多种流动相体系，比较发现使用甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸作为流动相时色谱峰分离效果较差，而使用乙腈-水作为流动相时分离度较好；此外，在流动相体系中加入冰醋酸有利于得到更好的峰形，考察了加入不同比例的冰醋酸，通过比较得出加入0.5%（V/V）的冰醋酸时效果最好。

4 小结

通过测定10批雪荔组方水提醇沉液的HPLC图谱，共标出14个共有峰，各批次间的相似度均较好，为组方提取工艺中间体的质量控制提供有效的理论依据。同时由于指纹图谱中只有高车前苷这一成分是可知的，谱图中其他成分还有待进一步深入研究，以保证指纹图谱的全面性[2]。

[1]Peng MM,Fang Y,Hu W,et al.The pharmacological activities of Compound Salvia Plebeia Granules on treating urinary tract infection[J].J Ethnopharmacol, 2010,129(1):59-63.

[2]马瑜红，李玲，欧阳静萍，等.荔枝草抗炎作用的实验研究[J].时珍国医国药，2008，19（9）：2209-10.

[3]童延清，李晖.紫花地丁、蒲公英体外抗菌作用研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2003，23（9）：669.

Study on the HPLC Fingerprints of Com pound Xueli*

HU Wei1,CHEN Ming-lei2,FANG Yun1**1Department of Clinical Pharmacy,the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008;2Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210046,China

HPLC fingerprints of Compound Xueli were established to provide an effective method of its quality control.An Agilent HC-C18column was used with acetonitrile-glacial acetic acid as the mobile phase for gradient elution;the flow rate was at 0.8mL·min-1;and the detection wavelength was at 335 nm.A total of 14 common peaks were identified and the similarities among different batches were all greater than 0.95.

Compound Xueli;Fingerprint;HPLC

R927

A

1673-7806（2012）05-476-03

江苏省中医药局管理项目（HZ1016KY）

胡巍，女，药师E-mail:huwei-82@163.com

**通讯作者方芸，女，主任药师Tel:025-83105660

2012-08-01

2012-08-23