喙尾琵琶甲提取物体外抗菌作用研究

施贵荣，庄孝龙，耿 玲，巫秀美，罗建蓉，刘光明

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

喙尾琵琶甲（ Blaps rynchopetera Fairmaire）属鞘翅目（ Coleoptera）拟步甲科（ Tenebrionidae）琵琶甲属（Blaps），是云南民间长期使用的昆虫药物，具有抗炎、抗菌、解毒等作用〔1〕。前期本课题组对喙尾琵琶甲乙醇提取物、水提取物、甲醇提取物进行了体外抗菌作用的研究，发现喙尾琵琶甲具有良好的体外抗菌作用〔2-3〕；为了进一步探讨其抗菌作用部位，本课题组对喙尾琵琶甲的乙醇提取物进行了硅胶柱柱层析，将得到的不同极性组分进行体外抗菌活性筛选，确定喙尾琵琶甲的抗菌活性部位。

1 实验材料

1.1 实验药材 样品采集自大理市凤仪镇，经毛本勇教授（大理学院农学与生命科学学院）鉴定为喙尾琵琶甲。

1.2 供试菌株 白色葡萄球菌（S.albus）、金黄色葡萄球菌（ S.aureas）、变形杆菌（ P.vulgaris）、枯草杆菌（ B.subtilis）、白色念珠菌（ C.albicans）、甲型副伤寒沙门菌（S.paratyphi A）。以上菌株均由大理学院基础医学院微生物与免疫学实验室提供。

1.3 培养基 水解酪蛋白琼脂培养基（简称M-H琼脂培养基）（杭州天和微生物试剂有限公司，批号070731）；细菌干粉培养基（简称M-H肉汤培养基）（杭州天和微生物试剂有限公司，批号070905）；液体沙氏培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20090905）；沙氏琼脂培养基（北京三药科技开发公司，批号20091105）。

1.4 仪器 YXQ-LS-50S11型立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；R-210旋转蒸发仪（ 瑞士BUCHI）；FD-1C-80冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 样品制备 取喙尾琵琶甲全虫，干燥后粉碎，加5倍体积的95%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液浓缩回收乙醇，得乙醇提取物；取500 g浸膏用80目硅胶拌样，干法上硅胶柱，用不同极性溶剂依次洗脱，浓缩得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇五个组分；将6份样品分别冷冻干燥低温保存备用。

2.2 最低抑菌浓度的测定 采用常量试管稀释法〔4-5〕测定喙尾琵琶甲提取物的最低抑菌浓度（MIC）。

2.2.1 菌液制备 从孵育10～12 h的非选择性培养基上挑取3～5个菌落，直接用灭菌生理盐水制成悬液并将浊度调至0.5麦氏比浊标准，相当于108CFU/mL的含菌量。 使用时用M-H肉汤稀释（ 1∶10），稀释后的菌液在15 min内接种。

2.2.2 药物稀释 取已处理好的无菌试管（15 mm×100 mm）14支，排成一排，每管加入M-H肉汤2 mL；在第1管中加入部位提取物（100 mg/mL）2 mL，混匀后取出2 mL至第2管，再次混匀后再取出2 mL至第3管，如此连续对比稀释至第11管，最后从第11管中取出2 mL弃去，保证每管终体积为2 mL。第11、12、13、14管分别为药物不加菌液对照、M-H肉汤对照、菌液对照和溶剂对照。此时各管药物浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.195、0.098 mg/mL。

2.2.3 抑菌实验 用M-H肉汤将调好的菌液作1∶10稀释相当于含菌液量大约为107CFU/mL，除第11、12、14管不加菌液外，其余每管加入菌液0.1 mL。置于37℃恒温培养箱中培养18～20 h后观察结果。

2.2.4 结果判断 在读取试验结果前，先观察生长对照管的细菌生长情况是否良好，并检查接种物的传代培养是否污染。然后以肉眼观察药物最低浓度管无细菌生长者则为该药物的MIC。再用微量加样器取出管中溶液100 μL密集划线转种于M-H琼脂平板或沙氏琼脂平板上，继续培养24 h，观察无细菌生长或者细菌数小于5个的药物最低浓度为最低杀菌浓度（ MBC）。

3 结果与讨论

3.1 结果 由喙尾琵琶甲制备得到的6份样品中，石油醚、氯仿、甲醇组分没有体外抗菌作用，乙醇提取物、乙酸乙酯组分、丙酮组分对6种测试菌的MIC及MBC见表1～3。

表1 喙尾琵琶甲乙醇提取物对6种供试菌的MIC及MBC

表2 喙尾琵琶甲乙酸乙酯组分对6种供试菌的MIC及MBC

表3 喙尾琵琶甲丙酮组分对6种测试菌的MIC及MBC

由表1可看出，喙尾琵琶甲乙醇提取物对所选菌株有不同程度的抑菌作用，对白色葡萄球菌的作用最好，MIC为5.21 mg/mL；由表2可看出，乙酸乙酯组分对所选菌株也有不同程度的抑制作用，对白色葡萄球菌的作用最好，MIC为1.30 mg/mL，且乙酸乙酯组分的抑菌作用比乙醇提取物好；由表3可看出，丙酮组分除白色念珠菌外，对其他菌株都有不同程度的抑制作用，对白色葡萄球菌的作用最好，MIC为7.29 mg/mL。3次重复实验结果基本一致。

3.2 讨论 目前，抗生素在临床应用最为广泛，是人类防治感染性疾病最为重要的手段；但抗生素存在很多不良反应的问题，同时细菌耐药性会引发医院感染增加，临床疗效下降，甚至会出现无药可选现象；而中药与抗生素相比具有以下优点：①具备非特异性抗菌作用并能调节及提高机体免疫力；②不良反应小，在体内药物残留量低；③较少细菌对中药产生耐药。因此，进行天然药物抗菌制剂开发是值得探索的研究方向，而我国的中医文化和丰富的天然药物资源为研究开发有效的抗菌制剂提供了最有利的保障〔6-7〕。

本研究通过体外抗菌实验，筛选出喙尾琵琶甲的抗菌活性部位。从实验结果可看出，喙尾琵琶甲乙醇提取物经硅胶柱柱层析后，石油醚、氯仿、甲醇组分没有体外抑菌作用，而乙醇提取物、乙酸乙酯组分、丙酮组分都对所测菌株有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯组分的抑菌作用最强，说明分离过程将抗菌活性组分富集到了乙酸乙酯组分。由此可得出以下结论：通过硅胶柱柱层析除去了乙醇提取物中没有抑菌作用的成分；乙酸乙酯组分的抑菌作用明显强于丙酮组分，所以乙酸乙酯组分为喙尾琵琶甲的体外抗菌活性组分；喙尾琵琶甲提取物对白色葡萄球菌抑制作用最好。

（本次实验用的菌株由大理学院基础医学院微生物与免疫学实验室提供，谨致谢意。）

〔1〕张兰胜，夏从龙，杨永寿，等.彝药喙尾琵琶甲的研究进展〔J〕.时珍国医国药，2009，20（ 12）：3113-3114.

〔2〕施贵荣，庄孝龙，孙会仙，等.喙尾琵琶甲抗菌活性的研究〔J〕.大理学院学报，2010，9（ 12）：18-19.

〔3〕施贵荣，肖培云，洪小凤，等.喙尾琵琶甲提取物体外抗菌作用初步研究〔J〕.时珍国医国药，2011，22（ 3）：622-623.

〔4〕陈奇，卞如濂，陈修.中药药理研究方法学〔M〕.2版.北京：人民卫生出版社，2006，274-277.

〔5〕马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册〔M〕.北京：科学出版社，2001：210-212.

〔6〕陈勇川，谢林利，熊丽蓉，等.黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的逆转作用研究〔J〕.中国药房，2008，19（ 9）：644-646.

〔7〕杨玉琴，姚楚水，马继周.中药皮肤消毒剂杀灭微生物效果的试验观察〔J〕.中国消毒学杂志，2003，20（ 2）：92-94.