重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白异构体鉴定

刘 巍，范 开

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(简称TNHH)系由大肠杆菌重组表达，经纯化精制而得的具有国内外创新性研究成果的注射药物。应用该工艺制备的TNHH理论氨基酸数为283个，理论相对分子质量为31525.5 D，理论等电点(PI)为4.57。由TNHH的氨基酸序列可知，在其结构中含有10个半胱氨酸，形成5对二硫键，因此，在制备工艺中存在因二硫键错配而形成的异构体。为了进一步去除异构体，本研究采用适宜的质控方法(RP-HPLC法、等电聚焦、非还原型SDS-PAGE凝胶电泳法、非变性PAGE法、活性分析、阴离子交换HPLC分析异构体)对异构体鉴定和含量比例进行控制。首先制备TNHH异构体并进行分析鉴定，在此基础建立一种质控方法分析并测定本品中异构体的最低限量，以达到TNHH中异构体含量不高于5.0%的国家生物药物异构体质量控制标准。

1 仪器和材料

1.1 仪器

Amersham Bioscience纯化仪(美国GE);Waters 600-2487系统液相色谱仪(美国Waters);Bio-Rad Universal电泳仪(美国Bio-Rad);Source 30Q预装柱(美国 GE);PL-SAX 1000A，8 μm，150 ×4.6 mm(美国Polymer Laboratories);SourceTM15Q，10×50 mm，15 μm(美国 Pharmacia);TU-1810 紫外可见分光光度计(北京普析);Spectra Max190酶标仪(美国MD);HHS-4S型电子恒温水浴锅(上海南阳);冷冻干燥机(Labconco);PHS-3C型PH计(上海大普);透析袋(Green Bird)。

1.2 材料

磷酸氢二钠(AR，上海生工);磷酸二氢钠(AR，上海生工);硫酸铵(AR，上海生工);乙酸钠(AR，上海生工);冰乙酸(AR，广东光华);乙腈(AR，广东光华);三氟已酸(AR，广东光华);蛋白Marker(北京天恩);凝血酶标准品(中国药品生物制品检定所);纤维蛋白原纯品(美国Sigma)。

2 方法

2.1 TNHH异构体的制备

采用原液制备工艺路线中Source 30Q层析分离TNHH不同异构体。试剂配制:A液为20 mM PB，0.2M(NH4)2SO4，pH 值为 8.0;B 液为 20 mM PB，0.4M(NH4)2SO4，pH 值为 8.0。设备:Amersham Bioscience纯化仪、Source 30Q预装柱。经复性和初纯化的样品，用A液平衡Source 30Q预装柱，样品电导稀释至25.0 mS/cm后上样，上完样后用A液平衡至基线;先用25%的B液洗脱TNHH，再用35%的B液洗脱异构体。将异构体组分对20倍体积的超纯水透析过夜，再用HPLC法测体积百分含量，按1.0 mg/支分装，冻干。

2.2 异构体的分析鉴定

2.2.1 RP-HPLC 法

具体操作按2005年版中国药典三部附录ⅢB“高效液相色谱法”［1］。仪器:Waters 600-2487 系统。色谱柱:WATERS symmetry 300TMC45μm，4.6×250 mm;色谱条件:流动相的A液为 5%乙腈+0.1%三氟已酸，B液为95%乙腈+0.1%三氟已酸;梯度为线性梯度30 min，B从0～100%;流速为1.0 mL/min;检测波长为214 nm;柱温为30℃;进样量为 20 μL。将 1.0 mg/mL 的 TNHH对照品、异构体以及两者混合样品进行RP-HPLC分析［2］。

2.2.2 等电聚焦分析

具体操作按2005年版中国药典三部附录IV D“等电聚焦电泳法”进行［1］。仪器:Bio-Rad Universal。电泳仪样品制备:TNHH对照品和异构体冻干粉用超纯水溶解至1.0 mg/mL。等电点标准品:取1支标准品用0.1 mL超纯水溶解，分别取20 μL 上样［3］。

2.2.3 非还原型SDS-PAGE凝胶电泳法

具体操作依照中国药典(2005年版三部)附录IV C“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”测定［1］。样品处理:取TNHH原液和TNHH异构体样品用超纯水稀释至浓度为1.0 mg/mL，按体积3:1的比例加入非还原型样品缓冲溶液，混匀，100℃水浴5 min，上样 10 μL［4］。

2.2.4 非变性PAGE电泳

具体操作依照中国药典(2005年版三部)附录 IV C“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”［1］。不同之处:电泳凝胶、电极缓冲液、样品缓冲液都不带SDS，即为非变性 PAGE 电泳［5］。样品处理:取TNHH对照品和异构体用超纯水分别稀释至浓度为1.0 mg/mL，取 100 μL 加入 25 μL 的 5 × 非变性样品缓冲液，混匀后直接取10 μL上样。

2.2.5 活性分析

1)抗凝血酶凝固活性测定法

依照中国药典(2005年版三部)附录Ⅹ F“抗凝血酶凝固活性测定方法”进行“TNHH抗凝血酶凝固活性测定方法”［1，6］。取TNHH 和异构体各一支配成相同浓度(0 ～ 32.0 μg/mL)，测定抗2.0 Iu/mL凝血酶的纤维蛋白原凝固时间。

2)抑制白细胞粘附活性测定(细胞法)

依照中国药典(2005年版三部)附录Ⅹ F“抑制白细胞粘附活性测定(细胞法)”进行“TNHH抑制白细胞活性测定方法”［1，6］。取TNHH 对照和异构体各 1 支(1 mg/支)配成 5.0、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.038 μg/mL 和空白对照，测定抑制人外周血白细胞粘附活性。

2.3 TNNH原液中异构体定量检测

采用RP-HPLC法、等电聚焦、非还原型SDSPAGE凝胶电泳法、非变性PAGE法、活性分析等鉴定方法只能对TNNH异构体进行定性或半定量检测［3］。根据TNHH异构体与TNHH的等电点差异，结合相关文献，采用阴离子HPLC来研究和建立本品TNHH中异构体的百分含量［7］。

2.3.1 色谱方法用不同pH值的分离效果

1)样品制备

取TNHH对照品和异构体各一支用DDW溶解成1.0 mg/mL，等体积混合后分进样20 μL。主要试验条件:仪器为Waters 600-2487系统;色谱柱为 PL-SAX 1000A，8 μm，150 ×4.6 mm;试剂为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙酸钠、冰醋酸、氯化钠。

2)试验方法

方法1 流动相A液:20 mM乙酸钠，pH值为6.0，0.2M 氯化钠;流动相 B 液:20 mM 乙酸钠，pH值为6.0，0.6 M氯化钠。梯度:20 min线性梯度，B液从0～100%。检测波长为214 nm，柱温为室温。

方法2 流动相A液:20 mM PB，pH值为8.0，0.2M 氯化钠;流动相 B 液:20mM PB，pH 值为8.0，0.6M 氯化钠。梯度:20 min线性梯度，B液从0～100%。检测波长为 214 nm，柱温为室温。

2.3.2 色谱方法用不同盐离子的分离效果(基于不同pH值的分离效果)

1)样品制备

取TNHH对照品和异构体各1支用DDW溶解成1.0 mg/mL，等体积混合后分进样20 μL。主要试验条件:仪器WEI Waters 600-2487系统;色谱柱 WEI PL-SAX 1000A，8 μm，150 ×4.6 mm;试剂为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙酸钠 、冰醋酸、氯化钠。

2)试验方法

方法3 流动相A液:20 mM乙酸钠，pH值为6.0，0.1 M 硫酸铵;流动相 B 液:20 mM 乙酸钠，pH值为6.0;0.5 M硫酸铵。梯度为20 min线性梯度，B液从0～100%。检测波长为214 nm，柱温为室温。

2.3.3 色谱方法用不同色谱柱分析(基于不同盐离子的分离效果)

1)样品制备

取TNHH对照品和异构体各1支用双蒸水溶解成1.0 mg/mL，等体积混合后分进样20 μL。分别用2根不同的色谱柱试验［8］。仪器为 Waters 600-2487系统。色谱柱 A为 PL-SAX 1000A，8 μm，150×4.6 mm。色谱柱 B为 SourceTM15Q(Pharmacia产品)，10 ×50 mm，15 μm。试剂为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙酸钠、冰醋酸、氯化钠。

2)试验方法

流动相 A液:20 mM乙酸钠，pH值为6.0，0.1M硫酸铵;流动相B液:20 mM乙酸钠，pH值为6.0，0.4 M 硫酸铵。梯度为20 min线性梯度，B液从0～100%。检测波长为 214 nm，柱温为室温。

2.3.4 TNHH异构体检出限分析(基于不同色谱柱分析)

1)TNHH异构体检出限分析样品的配制

取1.0 mg/mL的异构体，按5.0%的质量比加入1.0 mg/mL的TNHH对照品中，即含异构体的量为5.0%。进样20 μl，记录色谱图。结果计算:用峰面积归一化法计算异构体占总面积的百分率。色谱柱为 PL-SAX 1000A，8 μm，150 ×4.6 mm。仪器为Waters 600-2487系统。试剂为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙酸钠、冰醋酸、氯化钠。

2)试验方法

流动相A 液:20 mM 乙酸钠，pH 值为6.0，0.1 M硫酸铵;流动相B液:20 mM乙酸钠，pH值为6.0，0.4 M硫酸铵。梯度为20 min线性梯度，B液从0～100%。检测波长为 214 nm，柱温为室温。

3 结果与讨论

3.1 RP-HPLC 法

从图1～3可看出，在 RP-HPLC色谱图上TNHH与其异构体不能分离，保留时间一致。

图1 TNHH对照品

图2 TNHH异构体

图3 TNHH对照品+异构体

3.2 等电聚焦分析

从图4等电点测定结果得知异构体比TNHH等电点低0.5左右，二者能有效分离。

图4 TNHH和异构体样品等电聚焦电泳结果

3.3 非还原型SDS-PAGE凝胶电泳法

从图5结果得知TNHH和异构体二者在非还原SDS-PAGE上的迁移率一致，该方法不能鉴别样品中是否含有异构体。

图5 TNHH和异构体样品非还原型SDS-PAGE电泳结果

3.4 非变性PAGE电泳

由于本品属于酸性蛋白，可应用不含SDS的非变性电泳进行分析。从图6电泳结果可知，TNNH与异构体均呈单一条带，TNHH迁移率约慢于异构体。异构体在非变性PAGE电泳中的迁移率不同于TNHH，与其二、三级构象有关［4］。

3.5 活性分析

3.5.1 抗凝血酶凝固活性测定法

根据表1、2的数据，通过活性计算公式得到异构体抗凝血酶凝固活性为142 ATU/mg，TNHH对照品抗凝血酶凝固活性为465 ATU/mg，异构体比TNHH活性低70%。该方法不能鉴定TNHH和其异构体。

图6 TNHH和异构体样品非变性PAGE电泳结果

表1 凝血酶标准品纤维蛋白原凝固时间 s

3.5.2 抑制白细胞粘附活性测定(细胞法)

根据表3的数据，由IC50计算公式可知TNHH活性抑制白细胞活性IC50为156 ng/mL，异构体抑制白细胞活性IC50为370 ng/mL。TNHH异构体活性比TNHH活性约低50%。

表2 TNHH对照品和异构体抗凝血酶凝固时间 s

表3 TNHH和TNHH异构体抑制白细胞粘附活性吸光度

3.6 TNNH原液中异构体定量检测

3.6.1 不同pH值的分离效果

试验结果见图7、8和表4。从表4可知，流动相在pH值为6.0(即方法1)时，分离度略好于pH值为8.0(即方法2)时。

3.6.2 不同盐离子的分离效果

试验结果见图9和表5。从表5可知，硫酸铵(即方法3)的分离结果优于氯化钠(方法1)。因此，在方法3的基础上，用不同的色谱柱做进一步分析。

图7 方法1(低pH值)色谱图

图8 方法2(高pH值)色谱图

表4 不同pH值的分离效果结果分析

图9 方法3的色谱图

表5 不同盐离子的分离效果结果分析

3.6.3 不同色谱柱的分析效果

试验结果见图10、11和表6。从表6可知，通过降低B液中盐浓度(0.4 M硫酸胺)，异构体与TNHH的分离度提至大于1.5。在相同条件下PLSAX的分离度略优于 SourceTM15Q。经以上研究证明，在pH值为6.0的乙酸-乙酸钠和含不同梯度硫酸胺的流动相中两者分离度较理想。在色谱柱的选用上，PLX-SAX的分离度略优于SourceTM15Q，故选择PLA-SAX柱。

图10 PL-SA色谱图

图11 SourceTM15Q色谱图

表6 不同色谱柱的分析效果结果分析

3.6.4 TNHH异构体检出限分析

试验结果见图12及表7。从图7数据可知，经方法验证，应用该方法和色谱条件能有效检测出本品中含有5.0%以下的异构体。

图12 PL-SAX色谱图

表7 PL-SAX色谱图分析结果

4 结束语

从实验结果可以得出，在RP-HPLC法、等电聚焦、非还原型SDS-PAGE凝胶电泳法、非变性PAGE法、活性分析等方法中，只有等电聚焦和非还原型SDS-PAGE凝胶电泳法能分辨TNHH和异构体，可作为检定方法进行定性鉴定。而采用阴离子HPLC(PL-SAX色谱柱)法能对TNHH异构体进行百分含量定量鉴定，可作为检定方法进行定量鉴定。以上指标均达到《中华人民共和国药典》2005年版三部和《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》的要求，可对产品进行有效和可靠的质量控制，确保产品安全，并用于TNHH产品异构体检定。

［1］国家药典委委员.中国人民共和国药典:三部［S］.北京:化学工业出版社，2005.

［2］Zhao Rui，Ji JianGuo，Yuan HongSheng，et al.Separation of Rabbit Liver Metallothio NeinSub-isoforms by RPHPLC with MALDI-TOF-MS Detection［J］.Chemical Journal of Chinese Universities，2002，23(6):1086－1090.

［3］何忠效，张树政.生物化学实验技术丛书:电泳［M］.北京:科学出版社，1999.

［4］钱小红，贺初福.蛋白质组学:理论与方法［M］.北京:科学出版社，2002.

［5］张津辉，蒋中华，陈惠鹏.制备电泳中蛋白区带定位与染色方法的比较［J］.军事医学，1997(2):159-160.

［6］辛中帅，李克坚，杨化新，等.重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白质量标准研究［J］.中国新药研究杂志，2008，17(21):1865 －1868.

［7］Cirilli R，La Torre F.Stereoselective analysis of benazepril and its stereoisomersby reversed-phase high-performance liquid chromatography on a chiral AGP column［J］.Chromatogr A，1998，818(1):53 －60.

［8］刘钦伟，马仕珉，杨小明，等.HPLC法检查酒石酸布托啡诺原料药中右旋异构体［J］.药学进展，2008(10):460.