芽孢杆菌在石蜡油降解过程中的形态变化

余 瑛，卫泽峰，郭志龙，黄伟九，陈波水

(1.重庆理工大学 a.药学与生物工程学院;b.材料科学与工程学院，重庆 400054;2.后勤工程学院军事油料应用工程系，重庆 401311)

石蜡油是石油制品之一，性能稳定，很难降解。1971年Felix和Cooney［1］就曾经报道能形成芽孢的细菌在石油降解中具有重要作用，但迄今为止人们对微生物降解石油的详细机制仍不完全清楚。芽孢杆菌具有在营养充足时以营养体形态存在，营养贫乏时形成芽孢的特性［2－5］。芽孢杆菌以营养体呈现，则表明其生长旺盛，代谢活跃;若进入芽孢形成期则表明其进入休眠状态，代谢活性降低，甚至停滞［6－7］。芽孢杆菌由营养体到芽孢形态的转变是对环境变化所产生的应答，该应答导致芽孢杆菌内基因表达类型发生改变，进而产生表型变化［8］。因此通过芽孢杆菌的形态变化可以间接了解其对石蜡油的降解情况，为进一步明确微生物降解石油制品的机理和利用生物降解法进行环境污染治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

芽孢杆菌由重庆理工大学药学与生物工程学院实验室筛选、保存。

1.1.2 试剂

1)培养基

无机盐培养基:NaNO30.1 g/L;KH2PO40.1 g/L;CaCl20.03 g/L;NH4NO30.15 g/L;MgSO40.1 g/L;(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，痕量;pH 值为7.0～7.2。

模拟石蜡油污染废水:NaNO30.1 g/L;KH2PO40.1 g/L;CaCl20.03 g/L;NH4NO30.15 g/L;MgSO40.1 g/L;(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，痕量;石蜡油2 g/L;pH值为7.0～7.2。

富集培养基:牛肉膏 5 g/L;蛋白胨10g/L;NaCl 5 g/L;pH值为7.0～7.2;若制备固体培养基，则另外加入琼脂15 g/L。

2)芽孢染色试剂

7.6%的孔雀绿石饱和水溶液;0.5%的番红溶液。

1.2 方法

1.2.1 石蜡油降解过程中芽孢杆菌的生长情况

从分离培养基平板上分别挑取各细菌的单菌落接种于富集培养基中，30℃，200 r/min培养24 h，然后离心收集菌体。采用用无机盐培养基(菌体质量比重为9∶1的悬菌体)，将该菌悬液1 mL接种到100 mL的模拟石蜡油污染废水中，30℃，200 r/min培养。每隔 1 d取菌液测定OD600值。

1.2.2 石蜡油降解过程中菌体形态变化

首先取试验用芽孢杆菌接种于富集培养基中，30℃，200 r/min培养24 h，然后离心收集菌体。用无机盐培养基重悬菌体，接种到100 mL模拟石蜡油污染废水中(菌群数约为107cfu/mL)，30 ℃，200 r/min 培养，分别于 0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 d取样，用Schaeffer-Fulton氏染色法进行制片。制作过程简要叙述如下:用接种环从培养瓶中取2～3环，按常规方法将待检菌制成涂片;待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2～3次;加7.6% 孔雀绿水溶液于涂片处，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽，持续15～20 min;待玻片冷却后 ，用水轻轻冲洗至流出的水无色，用0.5%蕃红液染色5 min;水洗、晾干。于显微镜下观察菌体形态，发现芽孢呈绿色，菌体为红色。统计不同培养时间各制片中芽孢及菌体的比例，每个时期制片3张，每张制片统计100个芽孢及菌体。

2 试验结果

2.1 石蜡油降解过程中芽孢杆菌的生长情况

供试芽孢杆菌从富集培养基转入到模拟石蜡油污染废水中以后，3 d内有一生长迟滞期，4～8 d是其快速生长期，之后为衰退期(见图1)。迟滞期的存在表明芽孢杆菌对石蜡油的代谢途径所涉及的基因表达模式属于诱导型表达。芽孢杆菌从营养丰富的富集培养基中转入以石蜡油为唯一C源的模拟石蜡油污染废水中需要重新适应新的环境，启动与石蜡油代谢相关的基因表达，这样才能利用石蜡油进行生长。芽孢杆菌以石蜡油为唯一C源时其快速生长期的生长速度也较为缓慢，表明石蜡油是一种芽孢杆菌较难降解的C源。这与微生物对石油制品的利用率较低［9］的报道一致。

图1 芽孢杆菌在模拟石蜡油污染废水中的生长情况

2.2 石蜡油降解过程中菌体形态变化情况

在以石蜡油为唯一C源的模拟污染废水中，培养芽孢杆菌，间隔0.5或1 d取样制片，进行芽孢染色和显微观察。结果发现0.5 d开始有芽孢形成，3 d后营养体几乎完全转化为芽孢，5 d后芽孢又开始重新萌发形成营养体(见图2)。该结果表明，由于芽孢杆菌只有以营养体形态存在时才能利用石蜡油，因此芽孢杆菌分解石蜡油的速度较慢。因为石蜡油降解速度慢造成可直接利用的C源不足，因此0.5 d后芽孢才形成。后期芽孢重新萌发则表明与石蜡油利用相关的基因表达量增加或部分石蜡油降解成小片段后可利用度提高，C源不足的情况开始缓解。

图2 石蜡油降解过程中芽孢杆菌的形态及孢子形成率

3 讨论

芽孢杆菌能在以石蜡油为唯一碳源的培养基中生长，表明它能利用和降解石蜡油，但其生长速度较慢，并且要经历“营养体→芽孢→芽孢重新萌发形成营养体”的过程。尽管石蜡油的组分以直链烷烃为主，但仍然比较复杂。微生物降解石蜡油的过程可能涉及到多种基因的共同参与，从芽孢杆菌利用石蜡油时存在生长迟滞期和对芽孢杆菌生长形态的变化可以推测，芽孢杆菌中与石蜡油代谢相关的主要基因的表达属于诱导型，因此启动石蜡油降解需要较长的时间，最终导致芽孢杆菌在石蜡油中生长缓慢。

微生物对石油制品中各类不同组分的生物降解的难易程度与组分的结构相关，降解由易到难依次为:直链烷烃(n-alkanes)＞单环烷烃(monocyclic alkanes)＞烷基苯(alkyl benzenes)＞异戊二烯(isoprenoids alkanes)＞萘(alkyl naphthalenes)＞双环烷烃(bicyclic alkanes)＞甾(steranes)＞藿烷(hopanes)［10］。此外，环境因素如离子浓度、温度、pH值等也影响微生物对石油制品的降解［11］。因此，芽孢杆菌或其他微生物在对拥有更复杂结构的石油制品的降解过程中的生长情况和形态特点仍待进一步研究。

［1］Felix J A，Cooney J J.Response of spores and vegetative cells of Bacillus spp.in a hydrocarbon-water system［J］.J Appl Bacteriol，1971，34:411 －416.

［2］万俊杰，梁耀开，邓毛程.食品废水培养枯草芽孢杆菌产絮凝剂及固定化吸附Cu2+研究［J］.安徽农业科学，2011(14):8600 －8603，8686.

［3］姚小飞，叶璐，赵世敏.枯草芽孢杆菌的选育及其发酵豆粕的工艺条件研究［J］.安徽农业科学，2010(16):8476－8478.

［4］杨宇清，郑一敏，胡杨，等.枯草芽孢杆菌3－2产细菌素发酵条件的优化［J］.重庆理工大学学报:自然科学版，2011(11):39 －43.

［5］陈冲，佟建明，张潞生.地衣芽孢杆菌16S－ITS标记及其特异性分析［J］.安徽农业科学，2011(14):8206－8207.

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［8］Stragier P，Bonamy C，Karmazyn-Campelli C.Processing of a sporulation sigma factor in Bacillus subtilis:How morphological structure could control gene expression［J］.Cell，1988，52:697 －704.

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