聚合物分离介质在多肽分离中的应用

姜 和，付训忠，闵文杰

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400054;2.重庆前沿生物技术有限公司，重庆 400041)

多肽类药物的研究与开发是我国21世纪生物医药研究的重点方向之一。许多多肽对人的生理与病理过程，疾病的发生、发展及治疗有着重要意义，在临床上具有巨大的应用价值。然而在多肽类药物的研究与开发中，往往因在下游的分离与纯化过程中所存在的技术瓶颈，导致难以获得令人满意的目标多肽或制备规模。近年来一类新型的聚合物分离介质因其良好的分离效果、稳定的物理化学性质及高吸附载量，在多肽类药物的分离与纯化中得到越来越广泛的应用，也为多肽的分离介质选择提供了新的途径。

目前，在多肽分离纯化中最常用的分离介质是以硅胶为基质的反相填料(如 C4、C8、C18等)，然而以C18为代表的反相硅胶填料存在稳定性差、pH值使用范围窄(pH值为2～8)、易污染、难以清洗和再生等缺点，同时在反相体系中多肽会带有电荷，易被硅胶表面所带的硅醇基吸附，导致出现峰型展宽、拖尾等不利影响［1－2］。此外，一些碱性多肽在酸性条件下不能被分离，而只有在碱性条件下才能够被分离。为了克服反相硅胶分离介质固有的缺陷，学者们把注意力转向了一类新型的聚合物分离介质。此类分离介质的pH值使用范围大(pH值为1～14)，在强酸及强碱溶液体系中化学稳定性和粒径均一性好。其中在多肽分离中应用最多的反相聚合物分离介质表面无极性，不含键合的烷基官能团和残留的硅醇基，不易产生不可逆的吸附作用，并且能有效保持生物样品的活性，可代替反相硅胶应用于多肽类物质的分离纯化［3－4］。此外这些分离介质还能抵御极端条件下的在线清洗。在高pH值条件下的反相分离能够使分离度增加，并且提高碱性样品的溶解度［5－11］。

1 聚合物分离介质的发展、分类与性能

自20世纪60年代以来，聚合物作为色谱介质已被用于生物大分子的分离［12］。但受限于聚合技术等因素，早期的聚合物刚性较差，只能在低压、低流速下使用，不能用于高效液相色谱分析，且分离能力不佳，难以应用于药物的精细分离。化学键合相硅胶介质(如常用的C18介质)很好地弥补了聚合物介质刚性不足、分离能力有限等缺点，成为广泛应用于多肽的反相高效液相色谱分离介质［13－15］，但此类介质化学稳定性差，在强酸或碱性环境中长期使用会造成键合相脱落或基质溶解，严重影响色谱柱的分离效果和使用寿命。与使用范围限于pH值为2～8的硅胶类介质相比，聚合物分离介质不仅能耐受低pH值溶液，还能用NaOH溶液清洗和再生，更适用于多肽等生物分子在反相色谱中的分离，因此，近年来具有高机械强度、优异分离性能及良好化学稳定性的聚合物分离介质又重新引起了科研工作者的关注。

按照聚合基体的不同，聚合物可以分为聚苯乙烯型和甲基丙烯酸型，分别是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯为聚合单体，加入致孔剂聚合而成。早期的聚合物分离介质因孔径较大，称为大孔吸附树脂，其性质介于天然吸附剂(活性炭、硅胶和硅藻土)和离子交换剂之间，其吸附特性与天然吸附剂类似，比离子交换剂更容易再生，是吸附性和分子筛性原理相结合的分离介质［16］。根据其结构表面带或不带有不同极性的功能基，可分为非极性、中极性和极性3类［17］。目前大孔吸附树脂已广泛应用于中药提取液及多肽的分离纯化。但因大孔吸附树脂本身粒径较大等因素导致其分离能力较低，在物质的精细分离纯化中很难达到所需的纯化要求及质量标准。近年来随着聚合技术的发展，新型的精细聚合物分离介质随之诞生。精细聚合物分离介质一般是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯为单体聚合而成，其粒径分布为数微米至数十微米，比表面积达到600 m2/g，具有更好的粒径分布、更小的平均粒径和更高的比表面积，因此拥有更好的分离度和更高的吸附载量，加上其优异的化学稳定性，在多肽等生物分子的反相分离纯化中的应用也越来越广泛，且制备规模也越来越大。

合成聚合物介质的方法有种子聚合法、分散聚合法、悬浮聚合法和乳液聚合法等［18］。根据欲分离的蛋白多肽特性，可以在聚合物的基础上键合所需基团制成相应的分离介质(如离子交换层析介质)。在分离制备柱的类型上，也可以将制备柱制成颗粒预装柱或单体柱。其中单体柱是将聚合单体原地装入所需柱体内，再加入交联剂与致孔剂制成结构上的单体柱。相对于传统的颗粒预装柱，单体柱的使用不常见，但因其具有相对简单的聚合技术、良好的流体动力学特性及较小的传质阻抗，使其在多肽微量规模的分离纯化中的应用较多。

2 聚合物分离介质的应用

2.1 大孔吸附树脂的应用

大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类最早应用于物质分离的有机高分子聚合物吸附剂，因其良好的选择性吸附性能，使其早期被广泛应用于工业脱色、环境保护、天然植物中活性成分提取等领域［13］。近年来，随着生物技术的发展，使得大孔吸附树脂在生物活性物质生产上的应用逐渐增多。该树脂的优点在于在提取酶、氨基酸、蛋白质、肽等时的条件温和，设备简单，操作方便，可避免有机溶剂带来的环保、成本昂贵等问题，还可以避免由于加热、化学处理过程而造成生物活性降低。徐世芳等［19］在酪蛋白非磷肽的分离过程中，筛选了12种大孔吸附树脂，发现其中DA201－C大孔吸附树脂可以非常好地吸附酪蛋白非磷肽，去除其中的无机盐，酪蛋白非磷肽的回收率可达到95%。唐成康等［20］采用D101大孔吸附树脂，从山茱萸干果中提取到粗提物，再经SP Sepharose和Sephacryl S－300柱层析，得到一种具有抑制α－淀粉酶活性的糖蛋白(CoGP)。但随着药品质量标准的提高，以及蛋白多肽类药物自身特殊性，使得大孔吸附树脂在蛋白多肽类药物的分离纯化上的应用受到了极大的限制。蛋白多肽类药物的给药途径一般为注射给药，其对药品本身的安全性要求很高，而一般的大孔吸附树脂在聚合过程中加入的聚合单体与致孔剂会产生许多有毒的有机残留物，如苯、苯乙烯和二乙烯苯等，即使在后期的树脂预处理过程中也很难将这些有机残留物完全除掉。而这类残留物大部分属于一类有毒有机溶剂，因此极大地限制了其在蛋白多肽类，以及通过注射给药的药物分离纯化上的应用。但近年来国外科研工作者通过改进聚合技术研发出吸附力强、残留低的聚合树脂，如Rohm－Hass(罗门哈斯)生产的XAD系列、Organo(三菱化学)生产的HP系列等。这些吸附树脂在有机残留物的控制中能够达到很高的质量标准。其中Rohm－Hass的XAD16系列树脂还通过了美国FDA认证，使得其能够安全地应用于蛋白多肽类药物的分离纯化，也为大孔吸附树脂应用于注射给药类药物的分离纯化开创了先例。

2.2 精细聚合物分离树脂的应用

虽然有机残留低的大孔吸附树脂的出现，使得其在蛋白多肽类药物的分离纯化上的应用有了安全性的保障，但大孔吸附树脂的大孔径致使其分离能力受到限制，难以达到所需的分离能力，更难以应用于蛋白多肽类药物的精细分离。直到20世纪90年代，包括Rohm－Hass的CG与XT系列及Organo的CHP系列等在内的精细分离树脂的开发成功，才使得上述局面得以打破。此类精细分离树脂的优点在于粒径更小(分析型的平均粒径可以达到4 ～10 μm，制备型为20 ～100 μm)，比表面积大，均一系数高，刚性强度高，再结合聚合物本身的化学稳定性高，pH值适用范围广，吸附载量高等诸多优势，使得该类树脂近年来在植物有效成分、多肽、生长因子、酶、蛋白质等大分子物质的分离纯化中的应用越来越普遍，也取得了很好的分离效果，且可以放大至制备规模［21－23］。Jamil Mohammad 等［24］使用粒径 5 μm 的聚乙烯苯 － 二乙烯基苯聚合物预装柱(150 mm ×4.6 mm I.D)，在pH值为2～12的溶液中对血管紧张素肽混合物进行了分离条件研究的实验。实验结果表明，在以乙腈为洗脱液的反相分离条件和pH值为12(10mM/NaOH)的条件下多肽混合物得到了很好的分离，且分离度高于其他酸性溶液。Michiel H.M等［25］利用聚苯乙烯苯－二乙烯基苯聚合单体柱，在LC/MS模式下对其应用于蛋白降解物分析的可能性进行了研究。使用不同柱长的制备柱对含有9种蛋白混合物的蛋白降解物进行分离，发现随着柱长的增加，其峰容量明显增加。Quanzhou Luo 等［26］使用 10 μm 粒径的聚乙烯苯－二乙烯基苯聚合物制成的多孔开管式开放柱与强离子交换柱和质谱串联形成在线三维俘获柱，应用于蛋白质组学的超痕量物质研究。研究表明，在使用上述三维俘获柱对一种宫颈癌细胞株差异凝胶胰蛋白酶的降解物进行分离与分析时，最终包括癌症相关蛋白(如MAP激酶)的5047种多肽的1857种独立蛋白被识别与鉴定。

相对于聚苯乙烯型分离介质，甲基丙烯酸型分离树脂的研究起步较早，且多以聚合成的单体柱应用于物质的分离。从反相分离性能上比较来看，甲基丙烯酸型反相分离树脂的疏水性要低于聚苯乙烯型反相分离树脂，其在植物有效成分、酶及蛋白多肽的分离纯化上也有很好的应用。Lee等［27］使用甲基丙烯酸聚合而成的单体毛细管柱对核糖核酸酶A、细胞色素C、肌红蛋白、卵清蛋白混合物进行分离，在优化了的梯度洗脱条件下混合物得到了很好的分离。

我国在聚合物分离树脂上的研究相对于国外起步较晚，但近年来也相继开发出国产的聚合物分离树脂，并成功应用于包括蛋白多肽类在内的各种生物大分子的分离纯化。邵承伟等［28］采用聚苯乙烯－二乙烯基苯(PS－DVB)型麦科菲反相高效液相色谱柱 (MKF－RP－MH)对胸腺素 α1(Tα1)进行分离，采用乙腈为洗脱液进行反相梯度洗脱，在优化色谱条件(流动相A:0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，pH值为7.0或8.0;流动相B:乙腈，梯度洗脱条件 0～20 min，0～10%乙腈，20～30 min，10% ～30% 乙腈;温度:30℃;流速:0.8 mL/min;检测波长:214 nm)下分离了胸腺素α1标准品和样品。样品浓度在0.05～4.00 g/L时，线性方程为 C=0.0099A －0.078，r=0.9904，胸腺肽α1最大载量为6 g/L。实验结果表明:聚合物型MKF－RP－MH反相色谱柱可以代替传统的C18硅胶柱，很好地应用于Tα1的分离纯化。

3 反相聚合物型分离介质与反相硅胶(C18)在蛋白多肽分离纯化应用上的比较

3.1 应用于分离纯化所存在的优势

1)化学稳定性高。目前传统的C18反相硅胶填料是以硅胶为基体，键合上疏水基团，其pH值适用范围基本在2～8，pH值偏高或者偏低都会对填料本身产生损伤。特别是当pH偏高时硅胶基体会发生明显的溶解。而反相聚合物分离介质是以聚合单体为基体，加入交联剂聚合而成，没有键合相，在pH值为1～14的条件下都具有良好的化学稳定性。因此对于那些在碱性条件下具有良好分离效果的蛋白多肽混合物，反相聚合物分离树脂具有明显的稳定性优势。

2)吸附载量高。对于制备规模的混合物的分离纯化，分离介质的吸附载量的高低在很大程度上决定着分离纯化的效率与成本。相对于C18反相硅胶，反相聚合物分离介质在吸附能力上具有明显的优势。如在使用Rohm－Hass的CG系列反相树脂对牛血清蛋白进行分离实验时发现［29］:其有效分离载量基本达到30 mg/mL，且随着载样流速的增加，其有效分离吸附载量没有明显的变化;而 C18反相硅胶的有效分离吸附载量为10 mg/mL，当载量继续增大时其分离效果明显降低。

3)与C18在多肽的分离上具有很好的互补性。精细聚合物反相分离树脂的出现使得聚合物分离填料应用于蛋白多肽的分离纯化成为现实。对于C18反相硅胶填料较难分离的复杂多肽混合物，精细树脂可能具有更好的选择性。王静等［15］以二乙烯基苯为原料，采用微孔膜乳化－悬浮聚合法制备了粒径为25 μm的聚二乙烯基苯(PDVB)微球，考察了PDVB介质的物理性能及其作为半制备级反相高效色谱填料的分离性能和应用潜力，并且对PDVB微球在多肽分离上的性能进行了实验研究。实验以催产素、血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅰ和胰岛素的混合溶液为样品，在以TFA作为离子对试剂的条件下反相梯度洗脱分离，并且与相同粒径的商品化的C18球形介质进行了对比。实验结果表明:PDVB半制备柱对4种多肽的混合物能完全分离，各相邻两色谱峰的分离度均大于1.5，各峰的拖尾因子均在 1.00 ～1.35，峰形较对称，理论塔板数最高可达21000 m－1;而C18介质分离谱图峰形较宽，分离度及理论塔板数均不及PDVB介质，尤其是对于血管紧张素II和血管紧张素I，二者之间仅相差2个氨基酸残基，用C18介质难以将二者很好分离。PDVB介质实现了对二者的完全分离，说明在血管紧张素等多肽药物的分离纯化领域，PDVB介质有着很好的分离效果。

4)填料易于装填与再生。作为中低压分离介质，反相聚合物分离树脂更易于装填，而不需要像C18反相硅胶装填时所需的高压和特殊装填设备，更利于实验室研究制备规模的扩大和工业化生产。

3.2 应用于分离纯化所存在的缺陷

虽然随着聚合技术的发展，聚合物分离介质的刚性有了很大的改善，其耐压能力也相应有了很大的提高，但相对于包括C18在内的反相硅胶填料，其最大耐压能力仍低很多，因此也导致在装填时所允许的最大装填压力低很多，最终导致分离能力的下降。即使在相同粒径的情况下，聚合物分离介质也往往难以达到与反相硅胶相同的分离能力水平。

4 结束语

进入21世纪以来，生物医药技术得到了突飞猛进的发展，各种具有治疗作用的蛋白多肽类物质被发现，因此分离纯化这项下游技术在推动其产业化过程中显得尤为重要。聚合物分离介质的出现无疑为蛋白多肽类物质分离纯化介质的选择提供了一条新途径。聚合物分离介质自身所特有的高化学稳定性、高吸附载量弥补了传统反相硅胶填料的许多不足。近年来的研究与应用表明:聚合物分离介质在蛋白多肽类物质分离纯化中具有广泛的应用前景，并日益显示出其独特的作用与优势。相信随着研究的深入，不断涌现的各种性能更加优良的聚合物分离介质必将和其他各种分离介质一起推动着蛋白多肽类药物的研发，为生物医药技术的进步作出贡献。

［1］Sychov C S，Ilyin M M，Davankov V A，et al.Elucidation of retention mechanisms on hypercrosslinked polystyrene used as column packing material for high－performance liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，2004，1030:17－24.

［2］Zhelev N Z，Barratt M J，Mahadevan L C.Use of reversed－phase high－performance liquid chromatography on polystyrene－divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid－soluble nuclear proteins［J］.J Chromatogr A，1997，763:65 －70.

［3］Marjors R E.High－speed analyses using rapid resolution liquid chromatography on 1.8－microm porous particles LC GC［J］.Asia Pacific，2003，6(1):8 －12.

［4］Lloyd L L.Ion suppression reversed－phase high－performance liquid chromatography method for the separation of L－ascorbic acid in fresh fruit juice ［J］.J Chromatogr，1991，544:201 －217.

［5］Bennjet H P.Isolation of pituitary peptides by reversedphase high－performance liquid chromatography.Expansion of the resolving power of reversed－phase columns by manipulating pH and the nature of the ion－pairing reagent［J］.J Chromatogr，1983，266:501.

［6］Hearn M T，Aguilar M I.High－performance liquid chromatography of amino acids，peptides and proteins.LXVII.Evaluation of bandwidth relationships of peptides related to human beta－endorphin，separated by gradient－elution reversed－phase high－performance liquid chromatography［J］.J Chromaogr，1986，352:35.

［7］Tanaka N，Kimata K，Mikawa Y，et al.Performance of wide－pore silica－and polymer－based packing materials in polypeptide separation:effect of pore size and alkyl chain length ［J］.J Chromatogr，1990，538:13.

［8］Manning J N，Sullivan G S，Davis P F.Reversed－phase liquid chromatography of elastin peptides［J］.J Chromatogr，1989，487:41.

［9］Linde S，Welinder B S.Non－ideal behaviour of silicabased stationary phases in trifluoroacetic acid－acetonitrile－based reversed－phase high－performance liquid chromatographic separations of insulins and proinsulins［J］.J Chromatogr，1991，536:43.

［10］Ricker R D，Sandoval L A，Permar B J.Improved reversed－phase high performance liquid chromatography columns for biopharmaceutical analysis［J］.J Pharm Biomed Anal，1995，14:93.

［11］Visualising intraparticle protein transport in porous adsorbents by confocal microscopy.Renlund S.Application Note［P］.18－1130－93，Amersham Pharrmacia Biotech，Uppsala，1998.

［12］Sober H A，Peterson E A.Studies on the coenzyme activation of glutamic－aspartic apotransaminase.Chromatography of Proteins on Cellulose Ion－exchangers［J］.J Am Chem Soc，1954，76:1711 －1712.

［13］白泉，葛小娟，耿信笃.反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备［J］.分析化学研究简报，2002(9):1126－1129.

［14］黄鹤，万里鹏，吴蕾，等.液相色谱法分离纯化固相合成的胸腺素 α1［J］.化学工业与工程，2001，18(6):331 －335，353.

［15］WANG Jin，QU Huan－huan，HAO Dong－xia，et al.Preparation of Uniform Polydivinylbenzene Microspheres and Their Application in Reversed－phase Chromatographic Separation of Small Molecular Compounds and Peptides［J］.The Chinese Journal of Process Engineering，2009，9(4):763.

［16］宫霞，赵俊.大孔吸附树脂对酪蛋白酶解液的脱盐作用研究［J］.食品科学，2006，27(11):302.

［17］LIU Fei，ZHAO Ying.Macroporous absorbed resin and it’s application in separation and purification of natural product［J］.Qilu Pharmaceutical Affaira，2008，27(10):679.

［18］Ohtsuka Y，Kawaguch H，Sugi Y.copolymerization of Styrene with Acrylamide in all Emulsifier－flee Aqueous Medium［J］.J Appl Polym SCi，198，26:1637 －1647.

［19］徐世芳，毛丽珍.大孔吸附树脂及其在中药化学成分纯化中的应用［J］.浙江省医药科学院学报，2001(6):45－47.

［20］唐成康，高小平，徐大勇.山茱萸糖蛋白的纯化及部分理化性质研究［J］.天然产物研究与开发，2005，17(2):147－151.

［21］Cartier P G，Deissler K C，Maikner J J.The utility of polymeric reversed phase packings for the purification of peptides，proteins and antibiotics［M］.London，UK:Elsevier，1990:275－84.

［22］Cartier P G，Deissler K C，Maikner J J.Characterization of a family of polymeric resins with average pore diameters of 150，300，and 1000 for the preparative reverse phase purification of polypeptides［J］.Separations for Biotechnology，1994，158(3):100.

［23］Kinzey M，Deissler K，Fisher J.Strategies for Optimizing Peptide Purifications Using Amberchrom CG300SEuropean Forum on Advances［C］//Industrial Downstream Processing.Stuttgart，Germany:［s.n.］，1998:13 －15.

［24］Jamil Mohammad，Björn Jäderlund，Hans Lindblom.New polymer－based prepacked column for the reversed－phase liquid chromatographic separation of peptides over the pH range 2 － 12［J］.J Chromatography A，1999，852:255－259.

［25］Michiel H M，van de Meent，Sebastiaan Eeltink.Potential of poly(styrene－co－divinylbenzene)monolithic columns for the LC－MS analysis of protein digests［J］.Anal Bioanal Chem，2011:399:1845－1852.

［26］Quanzhou Luo，Ye Gu，Shiaw－Lin Wu，et al.Two－dimensional strong cation exchange/porous layer open tubular/mass spectrometry for ultratrace proteomic analysis using a 10 microm id poly(styrene－divinylbenzene)porous layer open tubular column with an on－line triphasic trapping column［J］.Electrophoresis，2008，29(8):1604－1611.

［27］Lee D，Svec F，Frechet J M J.Photopolymerized monolithic capillary columns for rapid micro high－performance liquid chromatographic separation of proteins［J］.J Chromatogr A，2004，1051:53.

［28］Shao Cheng－Wei，Wei Rong－Qing，zhang Ting－Ting，et al.Applica tion of Poly(styrene2div inylbenzene)Resin to the Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography for the Determination of Thymosinα1［J］.Chinese journal of Analytical Chemistry，2007，35(10):1491－1495.

［29］Tanaka N，Kimata K，Mikawa Y，et al.Performance of wide－pore silica－and polymer－based packing materials in polypeptide separation:effect of pore size and alkyl chain length［J］.J Chromatogr，1990，535:13 －31.