天龙核苷体外抗肿瘤作用的研究

宋 景 赵启韬 高 鹏 代 龙*

（山东中医药大学，山东 济南 250355）

天龙为壁虎科动物无蹼壁虎Gecko swinhoana Gunther.或多疣壁虎G.japonicum Dumeril.et Bibron.的干燥全体[1]，临床上常用于非小细胞肺癌，肝癌，肠道癌等恶性肿瘤的治疗，临床疗效确切，但其抗肿瘤物质基础尚不明确。近几年来研究报道，核苷类成分具有较强的抗肿瘤活性[2-4]，极有可能是天龙抗肿瘤物质基础之一，故本课题组以天龙核苷进行了体外抗肿瘤实验，以期探究、了解天龙核苷的抗肿瘤作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2-16pk型低温离心机（Sigma公司）；3111型CO2恒温培养箱（美国Forma scientific公司）；SW-CJ-1C型双人单面净化工作台（苏州净化有限公司）；Nikon Eclipse Ts100型显微镜（日本Nikon公司）；Nikon D5000型相机（日本Nikon公司）；台式恒温摇床（上海世平实验设备有限公司）；24孔细胞培养板；96孔细胞培养板；细胞培养瓶；滤器（Jet公司）。

1.2 试药

MTT（北京solarbio科技有限公司）；改良型RPMI-1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司）；新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；0.25%胰蛋白酶酶-EDTA溶液（北京solarbio科技有限公司）；DMSO（北京solarbio科技有限公司）； 顺铂（山东德州德药制药有限公司）。天龙核苷为本课题组自制（取干品，超纯水使其溶解，无菌滤器除菌，调整浓度为10 mg/mL，4℃保存）。

1.3 肿瘤细胞株

人红白血病细胞株K562，人非小细胞肺癌细胞株A549均由山东省医学科学院基础医学研究所孟红老师惠赠。肿瘤细胞株悬液制备：肿瘤细胞培养在改良型RPMI-1640培养基中（含10%新生牛血清）中，置37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中，24h后换液，贴壁细胞弃去上清液，PBS冲洗2遍，0.25%胰酶-EDTA液消化细胞，再用PBS冲洗2遍（悬浮生长细胞直接收集），用改良型RPMI-1640培养基调整浓度为每毫升含1×105个细胞的悬液，备用。

2 方法与结果

2.1 光镜观察细胞形态学改变[5]

将肿瘤细胞株悬液接种于24孔培养板，每孔1mL（含1×105个细胞），分别加入阴性对照剂（改良型RPMI-1640培养基）、不同浓度的天龙核苷液（500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）各100μL，每组均设4个复孔。培养36h后，光学显微镜下观察细胞形态学变化，并拍摄照片。

图1 对照组非小细胞肺癌细胞A549（10×）

图2 药物组非小细胞肺癌细胞A549（20×）

图4 给药组人红白血病细胞K562（20×）

2.2 MTT法[6,7]

将肿瘤细胞株悬液接种于96孔培养板，每孔100/μL（含1×104个细胞），分别加入阴性对照剂（改良型RPMI-1640培养基）、阳性对照（顺铂，DDP，浓度为250μg/mL）以及不同浓度的天龙核苷液（500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）各10/μL，每组均设6个复孔。置于37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养36h，于培养结束前4h各培养孔加入5μg/mL MTT20/μL，培养结束后，每孔加入DMSO 100/μL，置恒温摇床摇动15min（150 rpm/min），用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度（OD）值，测定波长λ=492nm，参考波长λ=630 nm，并计算抑制率。计算公式为：抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。

2.3 统计学方法

2.4 光镜检查细胞学形态结果

阴性对照的细胞生长旺盛，细胞明亮清晰，折光性好，细胞质分布均匀，核较大（图1，图3）。而给药组光镜下细胞变圆变小，折光性下降，出现发泡现象，染色质浓缩致密并分裂成块，多数细胞形成凋亡小体（图2，图4）。

2.5 MTT法结果

天龙核苷的体外抑瘤作用见表1。与对照组比较，天龙核苷类成分对K562及A549细胞株均有抑制作用，并有较好量效关系。对天龙核苷敏感的最低有效浓度分别是100μg/mL、50μg/mL半数抑制率（IC50）分别是277μg/mL和298μg/mL。

表1 不同药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用[OD值(±s) /抑制率(% )]

表1 不同药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用[OD值(±s) /抑制率(% )]

注：与1640培养液比较，*P≤0.05，**P≤0.01

组别 浓度(μg/mL) K562 A549 1640培养液 - 0.843±0.035/0 0.801±0.057/0 DDP 250 0.275±0.021/67.4** 0.224±0.012/72.0**天龙核苷 500 0.364±0.025/56.9** 0.358±0.016/55.4**250 0.447±0.028/46.9** 0.432±0.033/46.1**100 0.520±0.016/38.3** 0.474±0.015/40.8**50 0.707±0.040/18.3* 0.574±0.042/28.4**25 0.808±0.033/4.19 0.653±0.036/18.5*

3 讨 论

本课题组在研究天龙小肽类成分时发现了其含有核苷，采用碱化正丁醇萃取法制备了较纯的天龙核苷；本实验结果表明天龙核苷具有较强的体外抗肿瘤作用，极有可能是其抗肿瘤作用的物质基础之一，下一步在进行天龙小肽的课题基础上，应深入天龙核苷的抗肿瘤实验，以补充完善天龙的抗肿瘤研究。

[1] 山东省药品监督管理局.山东省中药材标准[S].济南：山东友谊出版社,2002：273.

[2] 严林,孔军,侯莉莉.核苷类似物的设计合成及其抗肿瘤活性[J].河南大学学报,2011,41(3)：257.

[3] 王丹,王宁,叶新山.杂氮核苷类似物的研究进展[J].中国药物化学杂志,2010,20(4)：319.

[4] 史丽宏,金东哲,周伟澄,等.3'-甲基呋喃核苷衍生物的设计合成与抗肿瘤活性[J].药学学报,2009,44(7)：747.

[5] 宋宇.吴茱萸碱抗肿瘤作用及其作用机制的研究[D].北京：北京中医药大学,2005.

[6] Vistica DT, Skenhan P, Seudiero D, et a.l Tetrazolium-based as says for cellular viability： a critical examination of selected parameters affecting formazan production [J]. Cancer Res,1991,51(10)：2515.

[7] Walencka E, Sadowska B, Rozalska S, et a.l Lysostaphin as a potential the rapeuticagent for staphylococcal biofilm eradication[J].Pol JMicrobio,2005,54(3)：191.