维生素D受体基因型、单体型与乳腺癌发病风险的相关性研究

黄友泽 陆红 白永恒 陈以勒 曾云祥 潘贻飞

维生素D受体基因型、单体型与乳腺癌发病风险的相关性研究

黄友泽 陆红 白永恒 陈以勒 曾云祥 潘贻飞

目的探讨维生素D受体(VDR)基因型、单体型与乳腺癌发病风险关系。方法选取146例乳腺癌患者和320例非癌女性对照人群为研究对象，应用PCR－RFLP检测VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236点的多态性，采用ELISA检测血浆中1，25(OH)2D3含量，结果用SPSS 13．0软件进行分析。结果3个位点中仅rs7975232基因型与乳腺癌发病相关。与纯合子GG相比，杂合子基因型TT具有较低的发病风险(P=0．001，OR=0．460，95%CI:0．286～0．740)。但不同的基因型之间1，25 (OH)2D3含量并无差异。此外，单体型AGT在病例组分布频率为3．8%，显著高于对照组的分布频率(0．8%，P=0．002);而单体型GTT在病例组的分布则显著低于对照组(19．8%vs 26．7%，P=0．018)。结论VDR基因与乳腺癌发病存在一定相关;携带单体型GTT的女性具有较低的患乳腺癌风险，而单体型AGT则发病风险较高。

维生素D受体单体型基因型乳腺癌

对象与方法

1．研究对象:收集温州医学院附属第一医院2009年3月～2010年5月住院后经病理确诊的146例乳腺癌患者，年龄分布为28～78岁，平均年龄为50．7岁。同时选取同期320例在该院进行健康体检的女性作为对照人群，对照人群均无相关临床症状，无肿瘤和遗传病史。对照组年龄为22～84岁，平均年龄为44．9岁。所有患者及健康对照人群均为汉族，且无血缘关系。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有受试对象或家属均知情同意。

2．研究方法:(1)标本采集、血浆分离和总DNA提取:抽取乳腺肿瘤患者和健康人群用EDTA·K2抗凝的外周血5ml，用全血DNA提取试剂盒(飞捷生物公司)提取全基因组DNA，置于－20℃保存，备用。(2)引物设计和基因分型:根据文献报道设计引物，由上海捷瑞生物公司合成［3］。PCR反应体系:10×EasyTaq Buffer 5μl，25mmol/L的MgCl20．5μl，各含25mmol/L的dNTP混合液0．5μl，10μmol/L的引物P1和P2各0．4μl，80～200ng DNA模板，5U/μl的EasyTaq DNA聚合酶0．25μl(TransGen Biotech)，加水至50μl。PCR退火温度、引物序列和酶切条件见表1。随机筛选部分样本送公司测序进行突变验证。(3)1，25(OH)2D3含量检测采用双抗体夹心ELISA法检测血浆中1，25(OH)2D3水平，即用抗人1，25 (OH)2D3单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的1，25 (OH)2D3与单抗结合，加入酶标抗体，形成免疫复合物连接在板上，加入酶底物TMB，出现蓝色，加终止液硫酸，颜色变黄，在450nm处测OD值。1，25(OH)2D3浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中1，25(OH)2D3浓度。

表1 PCR－RFLP技术分析VDR基因多态性引物和酶切条件

3．统计学方法:对照人群的3个位点基因型进行Hardy－Weinberg平衡检验，采用非条件Logistic回归分析基因型、等位基因在病例对照中的分布差异;采用两样本t检验分析不同基因型间1，25(OH)2D3含量差异。应用SHEsis平台评价VDR单体型分布差异，结果用P＜0．05作为判定统计上差异的标准［4］。

结果

1．乳腺癌和对照组VDR基因型和等位基因分布情况:图1显示rs1544410、rs7975232和rs731236位点的基因型电泳和测序结果。对照人群VDR基因3个位点的基因型进行Hardy－Weinberg平衡检验，检测得到基因型的观察值与预期值差异均无统计学意义，提示收集的样本具有群体代表性。此外，研究发现rs731236位点多态性与乳腺癌相关，见表2。与野生型纯合子GG相比，杂合子基因型TT在病例对照中的分布具有统计学差异(P=0．001)，经过年龄校准的OR=0．460，95%CI:0．286～0．740。

图1 VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236点的基因型电泳图和测序结果图

2．VDR基因型与血浆中1，25(OH)2D3的关系:随机挑选了90例病例组和90例对照人群检测血浆中的1，25(OH)2D3含量，结果显示病例组中其含量为524．83±380．45pmol/ml，明显低于健康对照人群中1，25(OH)2D3的含量(781．45±373．05pmol/ml，P=0．041)，但不同基因型之间1，25(OH)2D3的含量则无统计学意义(数据未列出)。

表2 乳腺癌和对照组VDR基因型和等位基因分布情况［n(%)］

3．VDR基因单体型分析:SHEsis软件显示VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236点存在较强连锁不平衡现象。对人群进行分析发现VDR基因以单体型GGT为主，GTT次之，而单体型AGC和GGC分布最少，如表3所示。本研究显示单体型AGT在病例组中分布频率为3．8%，明显高于对照组中的分布频率(0．8%，P=0．002);而单体型GTT在病例组中分布频率(19．8%)则明显低于对照组(26．7%，P= 0．002)。单体型结果提示携带有GTT单体型的女性具有较低的患乳腺癌风险(OR=0．666)，而AGT单体型则发病风险较高(OR=4．632)。

讨论

活性维生素D及其衍生物在体内对靶细胞的生理生化效应，不仅表现在调节骨骼、肠道的钙磷代谢，调节机体的免疫力，同样也表现在对肿瘤细胞的增殖和凋亡的调控作用。研究显示血清中低水平的1，25 (OH)2D3与乳腺癌的进展相关，这可能是通过关键分子维生素D受体(VDR)的介导，进而诱导细胞凋亡或经由RB－E2F通路来抑制乳腺癌细胞的增殖或转移来实现的［5］。此外，免疫组织化学结果显示VDR蛋白不仅在70%～90%的乳腺癌组织中有表达，并且在不同癌细胞系中表达水平不一样［6］。鉴于VDR结构和(或)功能，以及血循环中维生素D的水平可潜在地受VDR基因多态性的影响，故VDR的基因多态性与乳腺癌易感性的关系备受关注。

rs1544410(BsmI)、rs7975232(ApaI)和rs731236 (TaqI)位点是VDR基因最常见的SNP位点，均位于VDR基因3'末端，该区域的基因变异呈现出连锁不平衡现象，并且潜在地与VDR mRNA的表达水平相关［7］。多数学者认为rs1544410位点A等位基因的存在能降低乳腺癌的发病或转移风险。在英国和美国妇女中，携带有rs1544410 GG基因型分别会增加1．92和1．53倍发生乳腺癌的风险［8，9］。若血清1，25 (OH)2D3水平低于50nmol/L同时携带rs1544410 GG基因型的女性发生乳腺癌的风险则会增加到6.82倍［10］。对于rs731236位点，Lundin等［11］认为CC基因型患者的病死率(22%)远低于TT型(41%)或CT型(44%)的病人，且TT型病人的癌肿发生淋巴转移的危险比携带C等位基因的患者明显增加。本研究以浙江地区汉族妇女作为研究对象，未发现该两个基因型与乳腺癌相关，但发现rs7975232位点与乳腺癌相关，携带有TT基因型的人群较GG基因型患乳腺癌的风险低。我们的研究与来自于澳大利亚的研究结果相符，后者揭示G等位基因或GG基因型可以增加乳腺癌的患病率［12］。此外，单体型研究也发现GTT具有较低的患乳腺癌风险，而单体型AGT则发病风险较高。

此外，研究发现血浆中1，25(OH)2D3含量与基因型分布频率差异并无直接相关，提示基因型差异可能通过其他某种途径实现其对乳腺癌细胞的影响。然而本研究还存在一些不足，如研究还缺乏评价女性患者的绝经状态、ER和PR表达情况，另外，样本和分析的位点数量不足，未对多个人群进行横向比较研究等，相信做好这些方面才可得到更准确的结论。

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2Chen WY，Bertone Johnson ER，Hunter DJ，et al．Associations between polymorphisms in the vitamin D receptor and breast cancer risk［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14(10):2335－2339

3Bai Y，Yu Y，Yu B，et al．Association of vitamin D receptor polymorphisms with the risk of prostate cancer in the Han population of Southern China［J］．BMC Med Genet，2009，10:125

4Shi YY，He L．SHEsis，a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium，haplotype construction，and genetic association at polymorphism loci［J］．Cell Res，2005，15(2):97－98

5Hutchinson PE，Osbome JE，Lear JT，et al．Vitamin D receptor polymorphisms，associated with altered prognosis in patients with malignant melanoma［J］．Clin Cancer Res，2000，6(2):498－504

6Lyakhovich A，Aksenov N，Pennanen P，et al．Vitamin D induced up－regulation of keratinocyte growth factor(FGF－7/KGF)in MCF－7 human breast cancer cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2000，273(2):675－680

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10Guy M，Lowe LC，Bretherton－Watt D，et al．Vitamin D receptor gene polymorphisms and breast cancer risk［J］．Clin Cancer Res，2004，10(16):5472－5481

11Trabert B，Malone KE，Daling JR，et al．Vitamin D receptor polymorphisms and breast cancer risk in a large population－based casecontrol study of Caucasian and African－American women［J］．Breast Cancer Res，2007，9(6):84

12Lowe LC，Guy M，Mansi JL，et al．Plasma 25－hydroxy vitamin D concentrations，vitamin D receptor genotype and breast cancer risk in a UK Caucasian population［J］．Eur J Cancer，2005，41(8):1164－1169

(收稿:2012－01－05)

(修回:2012－02－17)

Relationship between Genotypes and Halpotypes of Vitamin D Receptor Gene and Breast Cancer Risk．

ObjectiveTo investigate the relationship between genotypes and halpotypes in the vitamin D receptor(VDR)gene and breast cancer risk．MethodsSamples were collected from 146 breast cancer patients and 320 non－cancer female controls．The genotypes were detected by PCR－RFLP and confirmed by sequencing．The levels of plasma 1，25(OH)2D3were measured by ELISA．The association between genotype and allelic frequencies with protein levels were calculated and analyzed by SPSS 13．0 software．ResultsOf three SNPs，only rs7975232 TT was shown to associate with 0．46－fold risk of breast cancer．No association of VDR genotypes and the levels of plasma 1，25(OH)2D3were found．Additionally，the frequency of haplotype AGT was 3．8%in cases，significantly higher than that in controls(0．8%，P=0．002)．However，the frequency of haplotype GTT in cases were significantly lower than that in controls (19．8%vs 26．7%，P=0．018)．ConclusionVDR gene polymorphisms are related to breast cancer risk．Individuals with haplotype GTT show lower risk，but the individuals with halpotype AGT have higher risk．

Vitamin D receptor;Genotype;Haplotype;Breast cancer

Huang Youze，Lu Hong，Bai Yongheng，et al．The 8th People Hospital of Wenzhou City，Zhejiang 325000，China

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，但其发病的确切分子机制到目前为止尚未清楚。近年来发现，维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)可能在乳腺癌的病因学中起着重要的作用［1，2］。本研究拟通过分析VDR基因3'端UTR区域rs1544410、rs7975232和rs731236点的基因型、等位基因和单体型，并检测血浆中1，25(OH)2D3含量，旨在从遗传功能学角度探讨其与乳腺癌遗传易感性的关系，从而有助于了解疾病的发病机制。

温州市鹿城区科技计划项目(S10106)

325000温州市第八人民医院检验科(黄友泽、陈以勒、曾云祥);温州医学院附属第一医院实验诊断中心(陆红);外科实验室(白永恒、潘贻飞)

白永恒，电子信箱:greatsailor@163．com