蛋白酶抑制剂leupeptin增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用

王莹 吴淑英 甄永苏

蛋白酶抑制剂leupeptin增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用

王莹 吴淑英 甄永苏

目的研究蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)leupeptin对化疗药物紫杉醇(taxol，TAX)、吉西他滨(gemcitabine，GEM)以及平阳霉素(pingyangmycin，PYM)在体外抑制肿瘤细胞增殖作用的影响。方法选取一定浓度梯度的酶抑制剂leupeptin单独或联合TAX、GEM和PYM与肿瘤细胞孵育，48h后采用MTT法测定肿瘤细胞生长的变化并与相应浓度的TAX、GEM和PYM单药组相比较。采用流式细胞术测定MCF－7细胞周期分布。结果leupeptin在浓度高于50μmol/L时可增强化疗药物对肺癌PG细胞和乳腺癌MCF－7细胞增殖的抑制作用。leupeptin对TAX的增效作用尤为显著。leupeptin与低浓度的GEM和TAX联合应用可改变MCF－7的细胞周期分布。结论leupeptin可增强化疗药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，但其作用程度与肿瘤细胞株的种类、化疗药物的种类及leupeptin的浓度均相关。

LeupeptinMCF－7细胞PG细胞增殖抑制

化疗增敏剂是指在所用浓度或剂量下没有抗肿瘤作用或抗肿瘤作用很小，但能影响已知有抗肿瘤作用药物的细胞毒作用，从而可增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用或降低其对正常组织细胞毒性的一类药物。目前对肿瘤化疗增敏剂的研究较多。主要侧重于多药耐药蛋白、药物代谢酶及DNA的修复等相关方面。另一些研究集中于改变肿瘤细胞的外周环境，以期待改良肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。目前的一些研究探讨微环境与肿瘤细胞之间相互关系，进而影响肿瘤细胞对于抗肿瘤药物的敏感性。此外还有一些学者研究基质金属蛋白酶抑制剂对血管生成的抑制，影响肿瘤细胞侵袭、转移和生长等。这些低分子化合物化学结构多样，作用于肿瘤细胞的多种靶点，对化疗药物的药效均起到了一定的促进作用。

leupeptin是一种广泛的丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制物，能抑制其他细胞中的程序化细胞死亡，被认为是参与凋亡进程的蛋白酶抑制剂，呈底物竞争抑制作用［1，2］。最初由X射线在小鼠C3H10T 1/2细胞的致癌性转化诱导的实验中，作为丝氨酸和巯基蛋白酶(如胰蛋白酶、血纤维蛋白溶解酶、木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B)的抑制剂。随后被证实可减弱化学致癌剂对大鼠的作用［3］。其分子结构为Acetyl－ Leu－Leu－Arginal，是一种低分子肽醛类化合物。多种细胞外周(包括细胞表面和释放于外周)的组织蛋白酶活性均可为leupeptin所抑制［4］。它作为一种工具药物被广泛的应用于生化实验中。多种研究表明leupeptin作用于肿瘤细胞的多种信号通路和多个靶点，主要作用于细胞迁移方面，对细胞内的多种酶类也有一定的影响。对于leupeptin的研究，涉及多种组织和细胞［5，6］。本实验拟研究leupeptin与化疗药物联合对肿瘤细胞增殖的影响。实验选取3种不同机制的抗肿瘤药物:抗代谢类药物吉西他滨(gemcitabine，GEM)、抗微管解聚类药物紫杉醇(taxol，TAX)和DNA干扰药物平阳霉素(pingyangmycin，PYM)，研究酶抑制剂leupeptin与化疗药物联合应用对肿瘤细胞增殖作用的影响。

材料与方法

1．材料:①细胞株:人高转移巨细胞肺癌PG细胞株和人乳腺腺癌MCF－7细胞株由本室传代保存;②leupeptin:美国Ameresco公司产品;③注射用盐酸吉西他滨:江苏森豪药业有限公司产品;④紫杉醇注射液:北京协和药厂产品;⑤注射用盐酸平阳霉素:天津太河制药有限公司产品。⑥MTT:购自北京经科宏达公司。⑦RPMI 1640培养基:Hyclone公司提供，标准胎牛血清:Gibco公司提供。

2．MTT法检测细胞的增殖作用:①细胞培养:PG细胞和MCF－7细胞用含10%胎牛血清的培养基RPMI 1640培养液在37℃，5%CO2条件下培养;②采用四氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的leupeptin与GEM、TAX和PYM单独及联合对PG与MCF－7细胞生长的影响。将细胞悬液以5000个/孔接种与96孔板中，培养48h后分别加leupeptin，3h后加入GEM、TAX和PYM。同时设置空白组、对照组和联合组。48h后以MTT法检测细胞毒作用，计算细胞存活率T/C(%)及两药相互作用指数(coefficient of drug interaction，CDI)。计算方法如下:细胞存活率T/C(%)=加药组细胞的吸光值/对照组细胞的吸光值×100%;CDI=AB/(A×B)。AB为两药联合作用组的T/C值，A、B是药物单独作用组的T/C比值。当CDI＜1时两药有协同作用。

3．PI单染流式细胞术检测细胞周期分布:离心收集药物处理过的细胞，用冰冷的PBS缓冲液冲洗后，离心倒掉上清保留少许液体，加－20℃预冷的乙醇至70%浓度，固定过夜，磷酸缓冲液洗3次后，经RNase消化30min，碘化丙锭(propidium iodide，PI)37℃染色30min以上，300目尼龙网过滤后，COULTER EPICS XL流式细胞分析仪测定细胞周期分布。

结果

1．leupeptin与GEM联合对肿瘤细胞增殖的影响:用MTT法检测不同浓度的leupeptin和GEM处理PG细胞和MCF－7细胞后，leupeptin与GEM的联合组对PG细胞和MCF－7细胞的生长的抑制作用较对照组(P＜0．05)略有增加。各实验组的细胞存活率见图1中A1和A2。同等剂量下，GEM对PG细胞的增殖抑制作用强于与MCF－7细胞。PG细胞和MCF－7细胞对leupeptin的敏感度不同。leupeptin可在一定水平增强GEM对MCF－7细胞的增殖抑制作用，但是对PG细胞的作用却较弱。在MCF－7细胞组中50μmol/L以上的leupeptin对各浓度组的细胞增殖抑制均有加强作用，100μmol/L leupeptin与5μmol/L的GEM的联合组与5μmol/L GEM单独组，细胞存活率分别为94．05%±1．92%和76．92%± 2.64%，100μmol/L leupeptin单独组为92．00%± 9.96%，两药的CDI值为0．892(CDI＜1)。而在PG细胞组中仅在高浓度的GEM组出现明显的增殖抑制加强，100μmol/L leupeptin与20μmol/L的GEM的联合组与20μmol/L GEM单独组，细胞存活率分别为56．08%±4．84%和66．21%±1．55%，100μmol/L leupeptin单独组为93．05%±3．32%，两药的CDI值为0．872(CDI＜1)。

2．leupeptin与TAX联合对肿瘤细胞增殖的影

图1 不同浓度leupeptin与GEM、TAX和PYM联合应用对MCF－7和PG细胞增殖的影响

3．leupeptin与PYM联合对肿瘤细胞增殖的影响:用MTT法检测不同浓度的leupeptin和PYM处理PG细胞和MCF－7细胞后，leupeptin与PYM的联合组对PG细胞和MCF－7细胞的生长的抑制作用较对照组(P＜0．05)显著增加。其细胞增殖的抑制率见图1中C1和C2。PYM的实验结果与GEM类似，leupeptin对MCF－7细胞抑制的增效作用较PG细胞为强。在MCF－7细胞组实验中100μmol/L leupeptin与20μmol/L的PYM的联合组与20μmol/L PYM单独组，细胞存活率分别为68．06%±1．14%和56.85%±7.14%，100μmol/L leupeptin单独组为92．00%±9．96%，两药的CDI值为0．926(CDI＜1)。在PG组细胞实验中100μmol/L leupeptin与1μmol/L的PYM的联合组与1μmol/L PYM单独组，细胞存活率分别为78．66%±1．39%和96．27%± 5.79%，100μmol/L leupeptin单独组为93．05%± 3.32%，两药的CDI值为0．878(CDI＜1)。

4．药物对细胞周期分布的影响:为进一步研究两药联合对肿瘤细胞增殖抑制的机制，采用流式细胞术检测药物对细胞周期分布的影响。药物分别作用于MCF－7细胞，48h收集细胞，PI染色后，流式细胞仪检测细胞周期分布。实验结果如图2和表1所示。与对照组相比，单独应用100μmol/L leupeptin对细胞周期无影响。leupeptin的加入可影响GEM和TAX对MCF－7细胞的细胞周期阻滞作用。100μmol/L leupeptin与2μmol/L GEM联合组可以使G1期的细胞比例增加，100μmol/L leupeptin与0.5μmol/L TAX联合组使S期细胞增加。

图2 leupeptin与GEM和TAX对MCF－7细胞周期时相分布的影响

表1 GEM、TAX和leupeptin联合应用对MCF－7细胞周期分布的影响

讨论

leupeptin广泛的应用于抑制多种的丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶类。它的作用特点是作用范围广，但是特异性不强，可作用于细胞生长及肿瘤形成的多个阶段。据报道leupeptin在体外可抑制胰腺癌细胞跨越基质胶屏障发生迁移［7］。其原因在于抑制了可降解肿瘤细胞外基质的蛋白酶类，这些酶类可参与肿瘤细胞的迁移。leupeptin可明显降低黑色素瘤细胞的迁移，该结果提示半胱氨酸水解酶在肿瘤迁移过程中具有重要作用［8］。组织蛋白酶B涉及多种肿瘤的的侵袭和转移，特别是细胞表面和分泌型的cathepsin B。而对cathepsin B和calpain相关的研究发现，leupeptin可以抑制该类cathepsin B［9］。通过比较了博来霉素人头颈部癌细胞的敏感细胞株和耐药细胞株后发现，leupeptin可提高耐药细胞株对博来霉素的敏感性，并表明细胞内的代谢酶参与了该细胞株的耐药过程［10］。

本研究结果表明leupeptin在体外可部分的提高TAX、GEM和PYM对肿瘤细胞增殖的抑制作用，但其本身并无明显的细胞毒活性，对细胞周期的分布也不会造成干扰。比较leupeptin在与上述3个化疗药物联合作用时的CDI值，在一定的浓度联合均有协同增殖抑制作用(CDI＜1)，100μmol/L leupeptin与20μmol/L TAX和200μmol/L leupeptin与5μmol/L TAX能够显著抑制细胞增殖，其CDI＜0．70，具有显著协同抗肿瘤作用。此外，TAX对肿瘤细胞增殖抑制作用的影响还具有如下的几个特点:①具有药物的选择性:对细胞毒性较强的药物如紫杉醇的作用效果较其他两种药物为显著，对多个药物剂量组均呈增强作用。而吉西他滨对肿瘤细胞的增殖抑制作用相对较弱，仅在高浓度的吉西他滨与leupeptin联合组出现了增强作用;②肿瘤细胞株对leupeptin的敏感性有差异。从本实验可以看出，MCF－7细胞对leupeptin的敏感度要高于PG细胞，在多种药物的多个浓度水平均有提高作用;③leupeptin需要在浓度较高时起效，呈现剂量依赖趋势。上述的几组实验数据显示，leupeptin至少要在浓度高于50μmol/L时才会起到增效作用。结合以上3个特点，可以看出leupeptin的作为增效剂的活性有特殊性。

在本研究中，MCF－7细胞对leupeptin的敏感性要高于PG细胞，尤其是与紫杉醇联合的药物组。相关的研究也探讨了各种化合物与化疗药物联合作用于乳腺癌细胞株，期望能改善化疗药物对乳腺癌，特别是HER－2高表达及多药耐药的细胞株的作用。包括天然提取物姜黄素、大黄酸和磷酸二酯酶抑制西地那非等多种低分子成为研究对象。据报道，在HER－2高表达的BT－474细胞株移植模型中发现姜黄素与紫杉醇的联合用药组的疗效与紫杉醇和herceptin的联合用药组相当［11］。赖氨大黄酸能有效抑制SK－Br－3细胞增殖并且能够通过HER－2信号通路诱导细胞凋亡，还参与了NF－κB/p53/p21等诱导凋亡的多种信号通路，有望成为临床肿瘤辅助化疗药物［12］。然而，对西地那非进行的相关实验则没有取得显著的效果［13］。综合上述的实验结果，leupeptin在体外对肿瘤细胞有明确的抑制作用。鉴于leupeptin广泛的作用位点，特殊的结构类型，希望通过进一步的研究，将leupeptin及其类似物应用于促进化疗药物的活性、调节细胞信号转导及诱导细胞分化逆转多药耐药等多种环节发挥抗肿瘤作用。

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(收稿:2012－01－16)

(修回:2012－03－07)

Protease Inhibitor Leupeptin Enhances the Inhibitory Effect of Anticancer Drugs on the Proliferations of Cancer Cells．

Wang Ying，Wu Shuying，Zhen Yongsu．Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Science＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

ObjectiveTo observe the modulating effect of leupeptin，a protease inhibitor，on the anti－proliferation efficacy of anticancer drugs including taxol(TAX)，gemcitabine(GEM)，and pingyangmycin(PYM)in cancer cells．MethodsMammary carcinoma MCF－7 cells and pulmonary carcinoma PG cells were exposed to various concentrations of leupeptin alone or in combination with taxol (TAX)，gemcitabine(EM)，and pingyangmycin(PYM)，respectively．After 48 hours exposure，cell proliferation was determined by MTT assay．Flow cytometry was used to analyze cell cycle distribution．ResultsAt the concentration of 50μmol/L or higher，leupeptin enhanced the inhibitory effect of those three anticancer drugs on the proliferation of both cell line．More marked enhancement was found in the combination of leupeptin and TAX．MCF－7 cell cycle distributions were changed at the low dosage GEM or TAX combination with leupeptin．ConclusionLeupeptin could enhance the inhibition effect of anticancer drugs，in particular，taxol，on cancer cells．The efficacy may be varied in different cell lines and drugs．

Leupeptin;MCF－7 cell;PG cell;Proliferation inhibitor

100050中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所

甄永苏，电子信箱:zhenys@cae．cn