骨基质明胶在异位成骨区的成骨研究

王瑞芳 秦书俭 田志逢

1.山西医科大学汾阳学院基础部解剖教研室，山西汾阳 032200；2.辽宁医学院，辽宁锦州 121001；3.漯河医学高等专科学校解剖教研室，河南漯河 462002

骨折愈合是一个受多因素影响的复杂过程，其中骨折区的血液供应对骨折愈合的效果起到非常重要的作用。本实验旨在研究不同处理后的骨基质明胶 （bone matrix gelatin，BMG）在兔股前内侧区的成骨效果，为临床骨折修复提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康5月龄日本大耳白兔40只，体重1.5～2.0 kg，雌雄不限。

1.2 制备BMG

取4只日本大耳白兔四肢骨、髂骨，将四肢骨的骺端及髂骨参照Urist[1]的方法制备成6 mm×5 mm×4 mm大小的BMG。

1.3 BMG的植入

将36只日本大耳白兔随机分为3组，10%水合氯醛腹腔麻醉后手术，在膝关节上方的股内侧区做一纵行切口，A组：BMG用2 μg/mL碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）浸泡过后将隐动、静脉游离 1 cm后顺行植入；B组：将隐动、静脉游离1 cm后植入未作任何预处理的BMG中；C组则直接将未处理过的BMG植入，不分离隐动、静脉。术后肌内注射4 万U庆大霉素，1次/d，共注射7 d。

1.4 血管灌注

术后4、8、12周，每个时间点取各组动物4只，10%水合氯醛腹腔麻醉后仰卧位固定于手术台上，暴露腹主动脉和下腔静脉，结扎腹主动脉近心端，在其远心端做离心插管，往动脉内注入大量肝素生理盐水同时剪开下腔静脉，直至静脉远端流出清亮、透明、无色液体时为止。然后从腹主动脉注入配好的复合墨汁，观察血管化情况，至下腔静脉有墨汁回流，远端皮肤、甲下颜色变黑时结扎下腔静脉，继续灌入少量复合墨汁。放置24 h后取出植入物，再放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.5 HE和Masson染色组织学观察及定量分析

将固定好的植入物行脱钙、脱水、冬青油透明后石蜡包埋、作纵横切片，厚度为5 μm，随后进行HE染色和Masson染色，倒置显微镜下观察血管化及成骨情况。根据体视学德莱塞原理，参照空间内某特征物的面积分数是其体积分数的估计，以Masson染色组织片中新生骨及血管的面积比来代表新生骨及血管化水平，在每个蜡块标本的上、中、下部分分别作连续横向切片5 片，置于显微镜下，在CIAS-1000 细胞图像分析系统下测算其新生骨面积比及血管面积比。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计软件包进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，组别之间作方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD-t检验；作新生骨面积比和血管面积比的线性相关分析，相关系数用r表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察

术后4周，A组移植物中央有少量的血管 （图1，见封三），B、C组的血管集中在材料边缘。术后8周，A、B组移植物中央血管量增加，其中A组增加较B组多，两组支架材料已经开始降解吸收，在新生的血管周围可见新生软骨组织（图2～3，见封三），C组无新骨形成。术后12周，A组材料大部分被新生软骨和骨组织代替，新生血管排列较有序，B组新生血管趋向于有序排列（图4，见封三），C组材料由大量纤维结缔组织充填，新生血管集中在材料边缘，并且排列紊乱。

2.2 新生骨面积定量分析

移植物新生骨面积比如表1 所示。表1 中可以看出，术后4周，A、B组与C组之间差异有统计学意义 （P＜ 0.05）；术后8周，A、B、C组之间互相比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；术后12周，A、B组与C组比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。

表1 移植物新生骨面积比比较（±s，%）

表1 移植物新生骨面积比比较（±s，%）

注：同一时间点与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，△P＜0.05；与C组比较，#P＜0.05

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2.3 新生骨面积比与血管化面积比相关分析结果

新生骨面积与血管面积图像相关分析结果见图5，r4周=0.53，P＜0.05；r8周=0.46，P＜0.05；r12周=0.61，P＜0.05。 表明新生骨面积比与血管面积比呈正相关。

3 讨论

有研究表明，组织工程骨的成骨效果受局部血运的影响，局部的血管化有助于组织工程骨的成骨，说明局部好的血运对成骨具有重要的意义[2]。

血液循环的建立，是一切成骨机制的基础。本实验新生骨面积和血管化面积相关分析可以看出，各个时间点新生骨面积比与血管化程度均呈正相关，血管化程度越高，新生骨面积越大。王永刚等[3]认为组织工程骨中央植入的血管束可以促发多中心成骨，不同于仅依靠周围血管逐渐向材料中心长入，随血管的长入而向心性成骨的单一渐进性过程。本实验中也发现了这种多中心成骨现象，其机制可能是血管束植入带入的细胞在一定条件下可转化为成骨细胞和破骨细胞，促进了移植物的成骨过程。骨性结构在崩解的过程中，形成了骨形态发生蛋白调控因子[4]。移植物的成骨过程，可能通过膜性化成骨和软骨化成骨两种过程相辅相成得以实现。

Leunig等[5]研究发现，体外环境下，bFGF抑制软骨细胞的分化。体内环境中，由于bFGF的促血管化作用，对新骨的形成有促进作用。在异位成骨中，bFGF可以通过增加新生血管的形成改善血供条件[6-7]。本实验中A组成骨效果好于B组，可能是因为A组中加入的bFGF的促血管化作用加速了新生骨的形成。

细胞支架材料是组织工程学组织的基础[8-10]。研究表明所用材料的性能和孔隙比促血管形成的生长因子对血管生长的影响更大。Pieper等[11]认为生物材料良好的生物相容性减少了异物反应，他们认为异物反应过程中炎症细胞的作用和植入物表面形成的纤维包膜不利于血管的长入。本实验新生骨面积分析可见A、B、C三组在术后12周时的面积比均比同组8周时小，分析其原因可能是因为实验所用的支架材料BMG是同种异体材料，生物相容性好，所以容易被降解吸收，随着血管化程度的不断增高，新生骨也不断地吸收改建，其吸收的速度大于新骨形成的速度，最终导致术后12周时新生骨面积比比术后8周时为小。金大地等[12]认为BMG在脱钙的基础上经过一系列处理，除去了磷蛋白、脂蛋白和蛋白多糖等大量非骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）物质，再经过冷冻处理，使其免疫原性降低，相对而言，BMP的纯度相应提高，而BMG的胶原结构变得松散，容易被宿主吸收，使周围新生血管及宿主细胞容易长入也是诱导成骨作用明显的一个重要原因。在本实验新生骨面积比和血管化面积比的相关分析中也可以看出，血管化程度越高，新生骨面积越大，这和金大地等人的研究结果是一致的。

虽然BMG作为支架材料具有上述诸多优点，但是实验中发现BMG存在吸收过快的问题，如果要应用于临床还需要进一步改变生物学性状，减慢其吸收速度。

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