慢性脑缺血大鼠脑星形胶质细胞反应性增生及EGb761的影响

仲玉洁

在中枢神经系统中，星形胶质细胞突起包绕神经元胞体及突起，构成神经元的微环境。它不仅支持、营养神经元，更能促进神经元的生长，提高神经元活力［1］。但是当慢性脑缺血(chronic cerebral ischemia，CCI))时，星形胶质细胞过度反应性增生，可产生具有神经毒性作用的细胞因子，并可通过刺激小胶质细胞增殖、释放细胞毒性物质和炎症介质而发挥神经毒性作用［2］。反应性星形胶质细胞增生在一定程度上反映了脑缺血缺氧的程度。本试验通过对慢性脑缺血大鼠模型给予国际标准含量的银杏叶提取物EGb761进行干预，观察其对慢性脑缺血损伤后星形胶质细胞反应性增生的影响，为其在慢性脑缺血的预防和治疗方面开辟新思路、提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 雄性SD大鼠30只，体重(220±30)g，由郑州大学实验动物中心提供。随机分成3组:A组为假手术组，B组为单纯缺血组，C组为EGb761干预组，每组10只。

1.2 药物与试剂 EGb761(达纳康，按国际标准银杏叶提取物要求选取，内含24%的银杏黄酮苷和6%的萜烯内酯)，40 mg/粒，由法国博福-益普生制药工业公司生产;GFAP抗体(胶质原纤维酸性蛋白抗体)，购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CCI模型鼠的复制 参考Wakita等［3］方法制备动物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100 g)腹腔内注射麻醉后，颈部备皮、消毒，颈正中切开皮肤，切口约1.5～2.0 cm，钝性分离筋膜、胸骨舌骨肌，分离出双侧颈总动脉，每侧用双线分别在近心端和远心端结扎，然后在两结扎处之间剪断颈总动脉制备出单纯缺血组和干预组模型，假手术组仅分离双侧颈总动脉而不结扎，缝合切口，对皮并消毒，放回原环境中饲养。

1.3.2 给药方法 将达纳康研成粉末状，用蒸馏水溶解并混匀，术后24 h按照0.5 m l/100 g予灌胃，单纯缺血组给予等量蒸馏水灌胃，各组灌胃均为1次/d，持续12周。

1.3.3 标本的收集与处理 大鼠经麻醉后，常规生理盐水及多聚甲醛灌注、固定，断头取脑，制作脑部冠状石蜡切片(厚度4μm)，采用免疫组化染色方法检测脑组织皮层、胼胝体及海马GFAP阳性细胞数的情况。

2 结果

大鼠脑胶质细胞GFAP的变化情况:各组均取皮层、胼胝体、海马处进行观察并统计GFAP阳性细胞数。单纯缺血组GFAP阳性细胞数明显多于假手术组和EGb761组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠皮层、胼胝体、海马GFAP阳性细胞表达情况(±s，n=10，个/400 倍高倍视野)

表1 各组大鼠皮层、胼胝体、海马GFAP阳性细胞表达情况(±s，n=10，个/400 倍高倍视野)

注:◆干预组与单纯缺血组比较P＜0.01，*单纯缺血组与假手术组比较P＜0.01

组别 皮层 胼胝体 海马假手术组12.9±1.66 17.0±1.49 10.5±2.55单纯缺血组 28.2±1.87* 28.5±1.58* 24.3±2.46*干预组 19.4±1.43◆ 22.0±1.49◆ 16.6±1.51◆

3 讨论

星形胶质细胞是中枢神经系统内在数目占绝对优势的一类胶质细胞，被认为在神经元的整个发育过程中起重要作用［4］，它参与中枢神经系统内神经元功能的调节，在维持神经元的生存微环境中起着重要的作用。缺血性脑损伤后星形胶质细胞增生并产生许多生物活性物质，对缺血损伤神经元具有保护作用;而星形胶质细胞在缺血性脑损伤后过度的增生并产生的生物活性物质，包括谷氨酸、钾、乳酸、花生四烯酸、NO和Ca2+流量变化等，反过来既可引起星形胶质细胞损伤和功能障碍，又可作为机械屏障影响髓鞘和轴索的再生，从而影响周围神经组织的结构修复和功能恢复，所有这些因素则可影响神经元存活［5］。反应性星形胶质细胞增生在一定程度上反映了脑缺血缺氧的程度。我们采用免疫组化GFAP标记星形胶质细胞的方法观察各组大鼠脑组织中星形胶质细胞的表达情况，结果显示，单纯缺血组大鼠皮层、海马、胼胝体内的GFAP表达较假手术组和干预组明显增多，提示慢性脑缺血损伤后，脑组织中星形胶质细胞反应性的过度增生。

国际标准EGb761，含24%的银杏黄酮苷和6%的萜烯内酯等多种活性物质，可协同作用于有关氧化应激、血液循环、神经递质和炎症反应等不同的病理过程。现已证实:EGb761中银杏黄酮为自由基清除剂，银杏内酯为特异性PAF受体阻滞药，对缺血时的神经有保护作用。

本实验应用EGb761对慢性脑缺血大鼠灌胃治疗，观察大鼠脑内星形胶质细胞数量的变化。实验结果显示EGb761干预组反应性星形胶质细胞增生的情况较单纯缺血组明显改善，提示EGb761能抑制脑缺血时星形胶质细胞的过度表达，这可能与EGb761能够针对反应性星形胶质细胞增生的多种损伤机制，如氧自由基、Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性作用和生物膜损伤等进行干预有关。尽管EGb761确实有神经保护作用，但其抑制星形胶质细胞过度增生的确切机制仍需深入研究。

［1］Ullian EM，Sapperstein SK，Christopherson KS.et al.Control of synapse number by glia.Science，2001，291(5504):657-661.

［2］Koprowski H，Zheng YM，Heber-Katz E，et al.In vivo expression of inducible nitric oxide synthase in experinmentally induced neurologic disease.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(7):3024-3027.

［3］Wakita H，Tominoto H，Kimurua J.Glia activation and whitematter change in the rat brain induced by chronic cerebral by hypoperfusion:an immunohistochemical study.Acta Neuropathol Ber1，1993，87:484-492.

［4］莫永炎，姜勇，陈瑗，等.脑星形胶质细胞生物学功能研究进展.生理科学进展，2002，33(1):71-74.

［5］熊晖，梁卫兰.围产期缺氧缺血性脑损伤中星形胶质细胞的病理生理改变.生理科学进展，2000，31(3):217-221.