未分类黄病毒研究进展

郭金金 燕清丽 孙肖红

(1.中国检验检疫科学研究院 北京 100123;2.承德医学院)

1 前言

黄病毒是一类重要的虫媒病毒(arbovirus)。虫媒病毒是指通过吸血的节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而引起自然疫源性疾病和人兽共患病的一组病毒，除了黄病毒属以外，还包括披膜病毒科甲病毒属(29种)、呼肠孤病毒科(77种)和布尼亚病毒科(350种)［1］。目前已知黄病毒属包括近70个具有抗原交叉反应的病毒，与人类疾病相关的约有

40 多种［2］，如黄热病毒(yellow fever virus，YFV)、登革病毒(dengue virus，DENV)、乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、西尼罗 病 毒(West Nile Virus，WNV)等。人、畜被携带病毒的节肢动物叮咬而感染，不但造成人类疾病和死亡，更会造成大批牲畜发病甚至死亡，造成巨大经济损失，成为各国的公共卫生问题［3，4］。

目前，一类只感染昆虫细胞(insect－only)的新型黄病毒被陆续发现，这种病毒只能在昆虫细胞系中增殖并引起细胞病变，却不引起哺乳动物细胞系的细胞病变。细胞融合因子病毒(Cell fusing agent virus，CFAV)、卡密提河病毒(Kamiti River virus，KRV)和库蚊黄病毒(Culex flavivirus，CxFV)都属于这类黄病毒。国际病毒分类委员会将这类病毒定为“未分类黄病毒(non－classified flaviviruses，NCFV)”

2 未分类黄病毒的发现

第一种被发现的未分类黄病毒是 CFAV，于1975年在埃及伊蚊细胞系中分离出［5］;第二种是卡密提河病毒(Kamiti River virus，KRV)，于1999年在肯尼亚中部的蚊虫体内分离得到［6］;第三种是日本在2007年首次在库蚊体内分离到的库蚊黄病毒(Culex flavivirus ，CxFV)［7］。2009 年在乌干达库蚊体内分离出的又一种新型未分类黄病毒Nakiwogo virus(NAKV)［8］。

2.1 CFAV 的发现

CFAV是第一个被发现的未分类黄病毒，1975年首次在埃及伊蚊细胞系的培养物中发现，研究表明该病毒能引起白纹伊蚊细胞融合，因此将这种病毒命名为细胞融合因子病毒(Cell fusing agent virus)。CFAV不能在金黄地鼠肾(BHK)细胞、人口腔上皮样癌(KB)细胞或非洲绿猴肾(Vero)细胞中进行复制，也不会导致BHK、KB或Vero细胞的融合。虽然CFAV的病毒结构特征与黄病毒类似，但是与黄病毒属其他成员间没有血清学交叉反应。此外，CFAV与黄病毒属其他成员的不同之处还在于其不能在几种脊椎动物的细胞如BHK、KB、Vero细胞内进行复制［5］，所以当时推测CFAV可能是类似B组披膜病毒科的病毒。直到1992年Cammisa－Parks等人确定CFAV的基因组核苷酸序列，通过将CFAV的核苷酸序列与GenBank中公布的核苷酸序列进行比较，发现CFAV与黄病毒属其他成员相似性最高的是非结构蛋白NS5基因(45%)和NS3基因(34%)，因此将CFAV归类为黄病毒科黄病毒属的新病毒种［9］，CFAV是当时研究发现的唯一已知的未分类黄病毒［10］。

随着研究的不断深入，近年又在波多黎各的现场蚊虫中分离到CFAV，这是第一次从野外蚊虫标本中分离到CFAV病毒［11］。在对波多黎各的蚊虫研究中，CFAV除了在埃及伊蚊体内分离到，还在白纹伊蚊及致倦库蚊体内分离到。研究发现蚊虫的性别与CFAV检出结果无明显影响，由此可以推断蚊虫能否感染CFAV与是否吸血并无关联。研究者用黄病毒属通用引物(PF1–PF2–PF3)进行半巢式RT－PCR，扩增黄病毒属NS5基因，用CFAV多个片段(NS1－NS5，E)及蚊虫物种鉴定的COI、COII基因片段的引物对蚊虫标本进行扩增，结果显示CFAV的相关基因序列已整合到伊蚊的基因组中，可能是因为蚊虫感染CFAV组的病毒而导致基因的整合［11］。

2.2 KRV 的发现

未分类黄病毒家族的第二位成员KRV，首次分离于肯尼亚的新黑蚊亚属的mcintoshi蚊虫体内。1999年在肯尼亚的低洼水坑采集蚊幼虫，在实验室饲养成成蚊，并进行病毒分离，在两批mcintoshi蚊虫标本中分离出两株只能在昆虫细胞复制而不能在脊椎动物细胞或小鼠的细胞中复制的病毒株。用甲病毒属、布尼亚病毒属和黄病毒属的引物进行RTPCR检测，只有黄病毒引物扩增出目的片段，序列比对发现这两株病毒和CFAV关系最为密切。另外，这两株病毒和已知的虫媒病毒之间没有抗原交叉反应，交叉中和试验表明这两株毒株为一种新的未分类黄病毒，因此就以当地地名卡密提河(Kamiti river)命名为卡密提河病毒(Kamiti River virus)［12］。

2007年肯尼亚医学研究中心的几位学者发现，埃及伊蚊对KRV易感性极高，成年雌蚊和蚊幼虫的感染率分别为62%和90.2%，被感染的蚊虫还可通过垂直传播传染给下一代［13］。

2.3 CxFV 的发现

未分类黄病毒的第三个成员是CxFV，在库蚊中分布广泛，因此被命名为库蚊黄病毒(Culex flavivirus)［7］。这种病毒和CFAV、KRV一样，只能在昆虫细胞中复制使其发生病变。进化分析显示，CxFV与CFAV、KRV进化关系最近。CxFV的3'非编码区包含四个串联重复序列，其中有两个重复序列与CFAV和KRV 3'非编码区的相似。这些结果表明，CxFV可能是一种新的昆虫黄病毒。

2009年在乌干达的蚊虫中也分离到CxFV，这是首次非洲分离到CxFV。而在对乌干达的蚊虫研究中Shelley Cook等人还在曼蚊种体内发现一种新的未分类黄病毒，初步命名为Nakiwogo virus(NAKV)，这种病毒与CxFV的亲缘关系最近［8］。

CxFV 还曾经从危地马拉和墨西哥［14，15］、美国得克萨斯州和特立尼达岛的致倦库蚊和Culex restuans库蚊中分离到［16］。台湾学者在虫媒病毒调查中，从三带喙库蚊中也分离出5株CxFV［17］。我国辽宁省在2009年和2010年虫媒病毒调查中从淡色库蚊中分离到4株CxFV，从中华按蚊、三带喙库蚊中各分离到1 株 CxFV［18～23］。

3 未分类黄病毒的结构

CFAV、KRV和CxFV跟其他黄病毒结构类似，是一种直径约为50nm的有包膜病毒，病毒基因组为单股正链RNA，全长约11kb。基因组包含一个开放阅读框(open reading frame ，ORF)，自5'至3'端依次编码结构衣壳蛋白蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E以及非结构蛋白 NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5，病毒RNA在细胞浆内直接起mRNA作用，翻译出结构蛋白和非结构蛋白，在胞浆粗面内质网装配成熟，出芽释放。

CFAV、KRV和CxFV三种未分类黄病毒的基因组大小存在一些微小的差异，其中CFAV病毒基因组全长约10.6－10.7kb，尽管CFAV的氨基酸序列和其他黄病毒的氨基酸序列相差很多，但是CFAV的蛋白酶的理化特性跟其他黄病毒是一样［11］。目前已公布全基因序列的未分类黄病毒共15株(表1)，其中CFAV 2株、KRV 1株、CxFV12株。唯一公布基因组全序列的 KRV基因组全长约为11.3 kb［6］，而CxFV除中国辽宁分离株基因组全长10.8 kb［18～23］，其余已公布序列的分离株基因组全长均为11.8 kb［7，15，16，24］。

表1 已公布全基因组序列的15株未分类黄病毒

目前研究较详细的CFAV三个结构蛋白中，E蛋白与其他黄病毒有很大不同。在对几个黄病毒的抗原反应时缺乏的血凝抑制活性，抗CFAV的血清与感染2型DENV，乙脑病毒或牛病毒性腹泻病毒细胞不发生任何发生反应［11］。

4 与其他黄病毒的关系

1999年国际病毒分类学委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第七次会议上，黄病毒属在生态学上被分为三组:蚊传黄病毒(Mosquito borne flaviviruses，MBFV)、蜱传黄病毒(Tick borne flaviviruses，TBFV)及无确定传播媒介的黄病毒(No Known Vector flaviviruses，NKV)［25］。但是，这种分类方案不包括 CFAV、KRV及CxFV。目前这三种病毒已被列入黄病毒属，冠名为未分类黄病毒(non－classified flaviviruses，NCFV)，这三种病毒并不属于虫媒病毒，而是感染昆虫的病毒，只在蚊虫体内存在，在实验室条件下它们只在蚊细胞系中复制［26］。

从黄病毒的遗传发育看，NCFV与蚊传黄病毒、蜱传黄病毒关系较远，属于其他黄病毒的远亲［27，28］。将 CFAV、KRV、CxFV 和其他黄病毒的 E基因进行遗传发育分析发现(图1)，CFAV、KRV、CxFV共同处于一个分支，其中CFAV、CxFV的遗传关系更近，KRV则独立于CFAV、CxFV，处于单独一个分支［7］。而乙脑病毒(JEV)、登革 2型病毒(DEN2V)、横濑病毒(Yokose virus，YOKV)，以及蜱传脑炎病毒(tick－borne encephalitis virus，TBEV)、阿波依病毒(Apoi virus，APOIV)则同处于另一个较远的分支中。2009年在对乌干达分离的昆虫黄病毒研究中，对NS5基因和整个OFR进行序列比对，结果与E基因遗传发育情况不同的是，CFAV与KRV 的关系更为密切［8］。

图1 NCFV的E基因的遗传发育树

5 与疾病的关系

目前研究，未分类黄病毒被认为是一种特殊的蚊虫病毒，并不引起人类疾病，到目前为止还没有在任何脊柱动物细胞中发现这种病毒的感染。但是，一些学者强调，随着生物进化，不排除这类病毒由蚊子传播给人类或其他动物的可能性［29］。近年发现的新发蚊媒病毒，如版纳病毒 (Banna virus，BAV)［30，31］和辽宁病毒 (Liaoning virus，LNV)［32，33］都与人类或动物疾病相关，因此未分类黄病毒对人类的潜在危害也不能忽视，未来这类病毒与人类疾病的关系将是今后研究的方向之一。

2007年Christophe N等发现CFAV丝氨酸蛋白酶的结构类似于其他黄病毒的NS2B/NS3复合体，这种复合体能催化裂解病毒的一些多聚蛋白，可能是抗黄病毒药物的作用靶位之一而受到广泛关注［34］。

6 结论与展望

从1975年从细胞培养物中分离得到CAFV到1999年从野外蚊虫标本中分离到KRV，过去了20余年，而近五年内就在野外蚊虫体内分离到两种未分类黄病毒，分别是2007年在日本发现的CxFV和2009年在乌干达发现的NAKV。蚊虫及虫媒病毒调查范围的扩大和实验室检测技术的提高是其主要原因之一。随着我国虫媒病毒研究的不断深入，相信也有可能分离到更多这类病毒。

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