定眩颗粒质量标准研究

祁 红，刘传统

(湖南省石门县人民医院，湖南 常德 415300)

定眩颗粒由制何首乌、枸杞、当归、白芍等11味中药组方，具有滋养肝肾功效，对美尼尔氏综合征等有较好疗效。为控制制剂质量，确保临床疗效，笔者建立了制何首乌、白芍、枸杞子、当归的薄层色谱鉴别方法，并采用高效液相色谱法对主要药味当归的主要成分阿魏酸和白芍的主要成分芍药苷的含量进行测定，现报道如下。

1 仪器与试药

岛津LC－10AT型高效液相色谱仪，SPD－10Avp紫外检测器，CLASS－VP色谱工作站;Meter AE240型电子天平。阿魏酸对照品(批号为110773－200611，供含量测定用)、芍药苷对照品(批号为110736－200424，供含量测定用)、当归对照药材(批号为9271－200110，供鉴别用)、何首乌对照药材(批号为0934－200106，供鉴别用)，枸杞子对照药材(批号为1072－0301，供鉴别用)，均由中国药品生物制品检定所提供;定眩颗粒(本院自制，批号分别为 100802，100815，100901);硅胶 G(青岛海洋化工厂);甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别[1]

2.1.1 制何首乌

取本品1 g，加乙醚25 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取何首乌对照药材0.2 g，加乙醚25 mL，同法制成对照药材溶液。按处方要求制成缺制何首乌的阴性样品，同供试品溶液的制备方法，制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各5～10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷－甲醇(7∶3)为展开剂，展至约3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷－甲醇(20∶1)为展开剂，展至约7 cm，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液则无，见图1 A。

2.1.2 白芍

取本品1 g，加乙醇50 mL，超声提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺白芍的阴性样品，同供试品溶液的制备方法，制成阴性对照品溶液。吸取上述3种溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇(4∶1)为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的主斑点，阴性对照品溶液则无，见图1 B。

2.1.3 枸杞子

取本品6 g，加水50 mL，回流30 min，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取枸杞子对照药材1 g，加水10 mL，同法制成对照药材溶液。取缺枸杞子的阴性样品，同供试品溶液的制备方法，制成阴性对照品溶液。吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸(2∶3∶1)为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液则无，见图1 C。

2.1.4 当归

取本品1 g，加乙醚50 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材0.2 g，加乙醚10 mL，同法制成对照药材溶液。取缺当归的阴性样品，同供试品溶液的制备方法，制成阴性对照品溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷－乙酸乙酯(17∶3)为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液则无，见图1 D。

图1 薄层色谱图

2.2 阿魏酸含量测定[2]

2.2.1 色谱条件

色谱柱:大连依利特 Hypersil ODS2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈 －0.085 mol/L(17 ∶83);流速:1 mL/min;柱温:35℃;检测波长:316 nm;进样量:10 μL。理论塔板数按阿魏酸计计算应不低于3 000。

2.2.2 溶液制备

精密称取阿魏酸对照品12.4 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10 mL，置100 mL量瓶中制成每 1 mL 含 12.4 μg 的溶液，即得对照品溶液。精密称取样品 1.002 4 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20mL，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

阴性干扰试验:取缺当归的阴性对照品，按供试品溶液制备方法制备，进样，测定。结果表明，处方中其他药味无干扰。色谱图见图2。

线性关系考察:分别精密吸取对照品溶液 3，5，10，12，15 μL，按上述色谱条件进样测定，以对照品峰面积积分值(Y)为纵坐标、进样量(X，μg)为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y=547 536 3.936 X+5 479 803.335，r=0.999 98(n=5)。结果表明，阿魏酸进样量在 0.037 ～ 0.186 μg 范围内与峰面积积分值线性关系良好。

图2 阿魏酸高效液相色谱图

精密度试验:精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样5次，按上述色谱条件测定。结果阿魏酸峰面积积分值的平均值为681 630，RSD=0.19%(n=5)，表明方法精密度良好。

重复性试验:取同一批样品(批号为100802)6份，依法测定。结果阿魏酸平均含量为 0.236 mg/g，RSD=1.33%(n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在 0，2，4，6，12，24 h时依法测定。结果峰面积积分值的 RSD=0.32%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

加样回收试验:取已知含量的样品(批号为100802)2 mL，精密加入一定量阿魏酸对照品，按供试品溶液制备方法制备溶液，依法测定，计算回收率。结果见表1。

表1 阿魏酸加样回收试验结果(n=6)

2.2.4 样品含量测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪测定，以外标法计算含量。结果批号为100802，100815，100901的 3 批样品中阿魏酸的含量分别为 0.236，0.245，0.267 mg/g。

2.3 芍药苷含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱:大连依利特 Hypersil ODS2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈 －0.1%磷酸溶液(14∶86);流速:1 mL/min;柱温:30℃;检测波长:232 nm;进样量:10 μL。理论塔板数按芍药苷计算应不低于2 000。

2.3.2 溶液制备

精密称取芍药苷对照品10.3 mg，置 200 mL 棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每 1 mL 含 51.5 μg的溶液，即得对照品溶液。精密称取样品0.8 g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，称定质量，放置过夜，超声处理40 min，放冷，称定质量，用稀乙醇补足损失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.3 方法学考察

阴性干扰试验:取缺白芍的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备，进样，测定。结果表明处方中其他药味无干扰。见图3。

图3 芍药苷高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密吸取对照品溶液 4，8，10，12，16 μL，按上述色谱条件进样测定，以对照品峰面积积分值(Y)为纵坐标、进样量(X，μg)为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=1 301 751 X －11 971.65，r=0.999 8(n=5)。结果表明，芍药苷进样量在0.206～0.824 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验:精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样5次，依法测定。结果芍药苷峰面积积分值平均值为651 257，RSD=0.45%(n=5)，表明方法精密度良好。

重复性试验:取同一批号样品(100802)6份，依法测定。结果芍药苷平均含量为 1.023 mg/g，RSD=1.07%(n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在 0，2，4，6，8，12 h 时进样(10 μL)，依法测定。结果峰面积积分值 RSD=0.87%(n=6)，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

加样回收试验:取已知含量的样品(批号为100802)6份，精密称定，精密加入一定量芍药苷对照品，按供试品溶液制备方法制备，依法测定，计算回收率。结果见表2。

表2 芍药苷加样回收试验结果(n=6)

2.3.4 样品含量测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪测定，以外标法计算含量。结果批号为100623，100701，100714的 3 批样品中芍药苷含量分别为 1.023，1.034，1.042 mg/g。

3 讨论

阿魏酸的含量测定参考文献[1]中方法，采用流动相乙腈－0.085%磷酸溶液(17∶83)或流动相乙腈－0.6 mol/L醋酸溶液(30∶70)，结果采用流动相乙腈－0.085%磷酸溶液(17∶83)时阿魏酸可以基线分离不受其他组分干扰，分离效果好，准确度高。芍药苷的含量测定参考文献[3]中方法，采用流动相甲醇－0.05 mol/L磷酸二氢钾(30∶70)、流动相乙腈 －0.1%磷酸(14∶86)、流动相乙腈－0.2%磷酸(14∶86)，结果芍药苷采用流动相乙腈－0.1%磷酸(15∶85)时可以基线分离不受其他组分干扰，分离效果好，准确度高。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:124，1 014，606，593.

[2]廉 莲，贾天柱.回生第一丹质量标准的研究[J].中成药，2008，30(12):220.