食用百合卷丹离体培养再生体系的建立

张传海，葛自兵，白雪峰，孙 婉

（1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安237012；2.安徽省舒丰现代农业科技开发有限公司，安徽 舒城231300；3.安徽省植物生物技术实训中心，安徽 六安237012）

食用百合卷丹离体培养再生体系的建立

张传海1，3，葛自兵2，白雪峰3，孙 婉3

（1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安237012；2.安徽省舒丰现代农业科技开发有限公司，安徽 舒城231300；3.安徽省植物生物技术实训中心，安徽 六安237012）

选取食用百合卷丹的鳞片作为外植体，以MS为基本培养基，添加6-BA和NAA的不同植物激素组合，分组进行不定芽诱导、继代增殖和诱导生根培养。结果表明，鳞茎的中层鳞片具有较强的不定芽分化能力，6-BA 0.5mg／L＋ NAA 0.1 mg／L的激素组合适宜于鳞片的不定芽分化和继代增殖，而最利于诱导生根的激素组合为NAA 1.0mg／L＋6-BA 0.1mg／L。组培苗经过60天左右培养可在培养基中直接产生小鳞茎。

百合卷丹；鳞片；不定芽；快速繁殖

百合为百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生宿根草本植物，因其根茎由多数肉质鳞片抱合和可治百病而得名。全世界共有90余种，原产我国的约有47种。百合是药食同源的著名经济植物，其鳞茎肉质鲜嫩，性味甘寒，富含营养，具有补中益气、养阴润肺、抗衰老、治肿瘤、提高机体免疫力等多种功效［1-3］。

地处皖西大别山区的六安市霍山、舒城、金寨等县，具有二十多年的食药用百合人工栽培历史，年种植规模达5万亩以上，霍山县“漫水河百合”于2010年被国家质量监督检验检疫总局批准为地理标志保护产品，已发展成为区域性特色农业产业［4］。

百合生产上，一般是通过分球、鳞片扦插等方式来进行繁殖。对霍山等百合规模种植区的田间调查发现，由于不规范的种球自繁、重茬栽培、病害预报与防治跟不上等原因，近年来主产区百合病害日趋严重，导致种性退化，百合产量和质量大幅度下降，对产业发展构成了直接威胁［5］［6］。因此，建立百合脱毒种苗生产技术体系和种球繁育供应基地，对于促进当地百合产业的健康发展具有重要意义。

植物组织培养技术在百合种苗快繁生产上有很大的应用空间［7-9］。本文以皖西大别山区百合主栽品种卷丹的鳞片为材料，研究外植体来源、培养基中植物激素配比等因素对于不定芽诱导发生、继代增殖以及生根成苗等组培过程的影响，并为进一步开展百合茎尖脱毒培养和建立规模化脱毒种苗生产技术体系提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供试百合品种为卷丹（Lilium lancifolium Thunb）。从霍山县漫水河镇种植基地采挖健壮的百合鳞茎带回，用沙埋藏备用。

1.1.2 仪器

电热蒸汽灭菌器（YX-450，上海三申），超净工作台（苏州净化），电子天平（上海精科）。

1.1.3 试剂

乙醇，升汞，萘乙酸（NAA），6-苄氨基嘌呤（6-BA），MS培养基配方中的各种试剂。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

基本培养基为：MS＋蔗糖30g／L＋琼脂粉50g／L。根据实验目的加入不同的植物激素组合；芽诱导培养基加入0.05%活性炭，芽增殖培养基和生根培养基皆不加活性炭。培养基的配制，按常规流程进行，调整pH值至5.8，分装后，高压湿热灭菌，冷凝备用。

1.2.2 外植体的消毒和接种

将百合鳞茎用自来水和软毛刷洗净，剥去最外层鳞片，选取洁白无病斑的鳞片作为外植体。在超净工作台上，将鳞片放入烧杯，加入75%乙醇浸泡10s，无菌水冲洗2次，然后将材料转入无菌烧杯中，加入0.1%升汞溶液浸泡10min，倒去升汞，无菌水冲洗4次。用灭菌滤纸吸去鳞片表面水分，在无菌培养皿内，将鳞片切分为大约0.6cm×0.8cm的小块，然后平放接种到芽诱导培养基上，每瓶接种4～6块。转入培养室，培养温度（24±2）℃，光照强度1200Lux，光照时间10～12h／d。

1.2.3 不同部位鳞片材料的芽诱导

剥离百合鳞片时，按自然生长的外层、中层、内层分为3类，分别消毒、切块和接种，培养30d，观察记录不定芽分化情况。

1.2.4 不同激素组合对不定芽分化的影响

将百合鳞片切块分别接种在附加6-BA和NAA不同浓度组合的MS基本培养基上培养，观察统计不定芽分化率和单块外植体的不定芽分化数量。

1.2.5 不定芽的继代增殖培养

当诱导产生的不定芽生长到0.6cm左右时，将其从鳞片外植体上剥离，选取长势良好均一的不定芽转接到增殖培养基上，培养30d，观察不定芽的增殖情况。

1.2.6 不定芽的诱导生根

不定芽继代增殖后，转接到生根培养基上继续培养，至第30d，统计生根情况。

1.2.7 数据统计方法

平均产芽数＝不定芽总数／产芽的总外植体数；不定芽分化率（%）＝（产生不定芽的外植体数／接种的总外植体数）×100；芽增殖倍数＝增殖后不定芽数／接种的不定芽数；平均生根率（%）＝（生根的不定芽数／接种的不定芽数）×100。

2 结果与分析

2.1 不同部位鳞片材料的不定芽诱导效果

鳞片切块接种到芽诱导培养基上培养2～3周，鳞片切口处发生膨大或凸起，不定芽逐步分化形成（图1）。至第30d，统计外层、中层、内层鳞片切块的不定芽发生数量，结果（表1）表明，不同部位来源的鳞片外植体，其分化产生不定芽的能力有显著差异，总体上呈现为中层＞外层＞内层，鳞片的所处部位对不定芽分化有明显影响。

表1 不同部位的鳞片材料诱导产生不定芽的效果

2.2 不同植物激素对诱导产生不定芽的影响

在MS基本培养基中添加不同浓度水平的6-BA和NAA激素组合，对中层鳞片切块的不定芽诱导效果进行比较，结果见表2。在设置的6个实验组中，以6-BA0.5mg／L＋NAA0.1mg／L的激素组合为优，芽诱导率达到83.3%，平均每个外植体分化产生的不定芽数为3.8个。就单一激素类别对芽诱导分化的效应而言，6-BA的使用浓度以0.5mg／L最佳，其次为1.0mg／L，0.1mg／L最差；而 NAA与6-BA的配比使用效果，0.1mg／L组皆优于0.5mg／L组。

表2 不同激素组合对中层鳞片诱导产生不定芽的影响

2.3 植物激素对不定芽继代增殖的影响

设定 NAA的浓度为0.1mg／L，改变6-BA的浓度，考查不定芽继代培养的增殖效果，结果（表3）表明，当6-BA的浓度为0.5mg／L时，增殖倍数最高，为3.60；继续提高6-BA的浓度，芽增殖倍数呈现明显下降。在6-BA为0.5mg／L的浓度水平上，以不添加NAA为对照，与添加NAA0.1mg／L的实验组相比，不定芽增殖数与增殖倍数有一定下降，但差异并不显著。

表3 植物激素对不定芽继代增殖的影响

2.4 不定芽的生根培养与小鳞茎发生

生根培养基的植物激素组合：6-BA固定为0.1mg／L，NAA 设置0.1、0.5、1.0、1.5mg／L共4个浓度；以不加任何植物激素为对照组。从继代增殖的不定芽中，挑取长势一致者接种到生根培养基中培养，第10d左右开始，不定芽的叶片抽展形成幼苗（图2），芽体基部陆续诱导生根，从而形成完整试管苗。培养至第30d，统计诱导生根情况，从表4结果可见，实验组 NAA1.0mg／L＋6-BA0.1mg／L的诱导生根效果最好，根多，根系发达健壮。

表4 植物激素对不定芽诱导生根的效果比较

观察发现，若完成上述诱导生根培养后不更换培养基，继续培养40d左右，试管苗发生枯萎，但每株苗会相应形成1～4个小鳞茎（图3），可作种球使用或扩大繁殖。

图1 鳞片不定芽的发生

图2 不定芽生长成苗

图3 试管苗产生小鳞茎

3 讨论

百合鳞片常被选择作为组培快繁的良好外植体。本研究以食用百合卷丹的鳞片为材料，探讨不定芽分化发生、继代增殖和诱导生根的基本影响因素，为进一步建立以茎尖培养为基础的百合脱毒种苗生产技术体系打下基础。

影响百合鳞片诱导分化的因素是多方面的［10］［11］。本实验结果表明，在培养基和培养条件一致的情况下，不同部位的鳞片，其不定芽分化率存在显著差异，中层鳞片的芽分化能力最强，其次是外层鳞片，而内层鳞片产生不定芽的数量最少。不同的外源激素组合对鳞片的不定芽分化也存在显著影响，本实验选用6-BA与NAA两种植物激素的不同浓度水平配比，考查对不定芽的诱导效果，以0.5mg／L6-BA与0.1mg／LNAA的组合最佳，不定芽诱导分化率达到83.3%，在此基础上提高6-BA的浓度水平反而会降低芽分化率。本实验在芽诱导培养基中附加了0.05%的活性炭，而我们做过与不加活性炭实验组的比较研究（结果未报道），发现MS基本培养基添加一定量的活性炭，不仅可以提高不定芽的诱导效率，而且产生的芽较为壮实，有利于后期增殖和生长。

通过对比实验，发现卷丹鳞片不定芽诱导的适宜激素组合也最适于芽的增殖培养，芽增殖的6-BA浓度以0.5mg／L最佳，而外源 NAA 保持在0.1mg／L的低浓度水平为宜。对于不定芽的诱导生根而言，NAA1.0mg／L＋6-BA0.1mg／L的激素组合诱导效果最好，产生的不定根多，根系发达健壮。

关于百合的组织培养已有大量研究报道［12］。不同品种、不同地域的实验材料，对于研究结果可能具有直接影响，得到的结论会呈现差异化，因此，实际研究或生产中，应充分考虑到基因型、内源性激素等因素的影响，建立科学客观的技术体系。

［1］周佳民，朱校奇，彭福元，等.食用百合规范化栽培技术［J］.安徽农学通报，2009，15（3）：206-208.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2005.

［3］熊丽，王祥宁，张艺萍，等.百合种球国产化的回顾及发展商榷［J］.西南农业学报，2008，21（3）：859-862.

［4］储成虎，武丽，许自文，等.皖西大别山区食用百合无公害高产栽培技术［J］.安徽农业科 学，2005，33（11）：2068-2069.

［5］邓余良，彭慧，金鑫.皖西山区药百合病害流行原因及其防治技术［J］.现代农业科技，2006，（8）：63-64.

［6］张健，许自文，何新祥.霍山县百合品种退化原因及对策［J］.上海蔬菜，2006，（3）：13-14.

［7］张建华，庄天明，陈银华.百合无病毒苗快速繁殖技术［J］.上海交通大学学报（农业科学版），2006，24（4）：370-373.

［8］王海新.东方百合种球脱病毒快繁及生产技术［J］.现代农业科技，2008，（12）：75-76.

［9］张艺萍，屈云慧，王祥宁，等.提高百合茎尖组织培养脱毒效率研究［J］.广东农业科学，2007，（1）：37-38.

［10］王延秀，张金文，师桂英.东方百合鳞片组织培养研究［J］.甘肃农业科技，2009，（2）：8-11.

［11］储俊，许娜，龚义平，等.安徽霍山药百合组织培养的研究［J］.安徽农学通报，2009，15（14）：39-42.

［12］李筱帆，张启翔.百合组织培养和植株再生的研究进展［J］.安徽农业科学，2009，37（4）：1479-1482.

Establishment of Regeneration Systems by Squama Culture of Lilium LancifoliumThunb

ZHANG Chuan-hai1，3，GE Zi-bing2，BAI Xue-feng3，SUN Wan3
（1.College of Biological and Pharmaceutical Engineering，West Anhui University，Lu’an237012，China；2.Anhui Shufeng Modern Agriculture Science and Technology Development Limited Company，
Shucheng231300，China；3.Plant Biotechnology Training Center of Anhui Province，Lu’an237012，China）

Squamas of edible lily bulbs of Lilium lancifoliumThunb were used as explants，and MS media added different combination of 6-BA and NAA were employed for adventitious bud induction，bud multiplication subculture and root induction.The results showed that bud differentiation ability of outward squamas was better than that of inward ones，the medium MS＋6-BA 0.5mg／L＋ NAA 0.1mg／L was optimal both to bud induction and to bud multiplication，and the optimal medium for rooting was MS＋ NAA 1.0mg／L＋6-BA 0.1mg／L.Small bulbs directly generated from seedlings after an about 60days’continuous culture in the medium.

Lilium lancifolium；Thunb；bulb squamas；adventitious buds；rapid propagation

Q813.1

A

1009-9735（2012）02-0001-03

2012-02-12

安徽省高校省级自然科学研究重点项目（KJ2012A278）。

张传海（1965-），男，安徽金寨人，教授，博士，研究方向：植物生物技术。