百合总皂苷提取工艺及抗抑郁活性研究

傅春燕，刘永辉，李明娟，王晓慧，尹文清

1邵阳医学高等专科学校;2湖南省新邵县红十字会医院，邵阳 422000;3广西师范大学化学化工学院药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室，桂林 541004

百合总皂苷提取工艺及抗抑郁活性研究

傅春燕1*，刘永辉2，李明娟1，王晓慧1，尹文清3

1邵阳医学高等专科学校;2湖南省新邵县红十字会医院，邵阳 422000;3广西师范大学化学化工学院药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室，桂林 541004

本文研究百合总皂苷最佳提取工艺，继而采用AB-8大孔吸附树脂富集纯化百合总皂苷，并测试其抗抑郁活性。采用正交实验，考察乙醇浓度、提取次数、固液比及提取时间四个因素对该工艺的影响;采用小鼠悬尾实验和小鼠强迫游泳实验评价百合总皂苷的抗抑郁活性。确立了百合总皂苷的最佳提取工艺为:提取时间3 h，乙醇浓度80%，固液比1∶10，提取次数为3次。在最佳提取工艺条件下，总皂苷提取率为1.24%。经过AB-8大孔树脂富集纯化总皂苷的含量达到62%以上。药理实验表明，百合总皂苷中剂量、小剂量能明显缩短小鼠悬尾的不动时间和游泳时间(P＜0.05或者P＜0.01)，百合富集纯化的总皂苷部位具有较好的抗抑郁活性。

百合总皂苷;提取工艺;抗抑郁活性

百合(Lilium browniiF.E.Brown var.viriulum Baker)为百合科多年生草本植物，为湖南邵阳特色的一种药食两用的名贵中药材，主产于湖南新邵、隆回、邵东等地。百合在历代本草中均有安神功效的记载，在张仲景《金匮要略》中主要用于治疗“百合病”，而现代医学的抑郁症属于“百合病”的范畴。百合鳞茎主要含有甾体皂苷、酚性甘油苷、多糖、氨基酸、磷脂以及微量元素等成分［1-3］。现代药理研究表明，百合具有养阴润肺，清心安神、止咳、消炎、增强肌体免疫功能等功效［4-6］。中国药典收载的百合为:卷丹(Lilium lancifoliumThunb.)、百合(Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker.)和细叶百合(Lilium pumilumDC.)。经检索文献［7，8］，卷丹总皂苷的提取工艺及其药理活性有一些报道。而百合中总皂苷的提取工艺和抗抑郁活性研究尚未见文献报道。本文拟采用正交实验研究了百合总皂苷的最佳提取工艺条件，以总皂苷提取率为指标，系统地考察了溶剂浓度、固液比、提取时间、提取次数等因素的影响，最后优选出了最佳提取方案，并对采用该方案提取的百合总皂苷进行富集纯化及抗抑郁活性评价。上述研究为开发以百合为原料的抗抑郁中药奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百合由湖南康尔佳中药饮片厂提供，药材由广西师范大学生命科学院唐绍清教授鉴定为百合科百合属植物百合(Lilium browniiF.E.Brown var.viriulum Baker)地下鳞茎部分。薯蓣皂苷对照品(供含量测定用，批号111701-200711)购自中国药品生物制品检定所。盐酸氟西汀片:常州四药制药有限公司，规格1 mg/片，批号:070429。其它试剂均为分析纯。AB-8大孔吸附树脂(南开大学)。

5%香草醛溶液:称取香草醛0.5 g，置于10 mL容量瓶中，冰醋酸溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。KM小鼠，♀♂各半，体重18～20 g，由湖南农业大学动物医学院提供。

1.2 仪器与设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);KQ-500DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 样品提取工艺

称取百合干燥鳞茎10.0 g，按表1所示的正交条件，采用不同体积分数的乙醇加热回流提取，合并所得浸膏加水溶解，依次用乙醚、水饱和的正丁醇萃取，合并并减压蒸干萃取液，干燥得到百合总皂苷。

1.3.2 百合总皂苷类成分的定量测定方法

以薯蓣皂苷为对照品，根据甾体皂苷类化合物的香草醛-高氯酸显色反应，用分光光度法测定皂苷含量并计算百合总皂苷提取率。

精密吸取样品溶液1 mL置于10 mL瓶中，低温烘干溶剂，冷却，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，再加入高氯酸0.7 mL，混匀，置于60℃水浴20 min，取出，迅速冷却。精密加入冰醋酸液5 mL，摇匀，在暗处放置30 min，在535 nm波长处测定吸光度，计算样品中总皂苷的总量。

皂苷提取率% ={(提取液中皂苷总量)/(所用百合原料量)}×100%

1.3.3 正交实验

选取乙醇浓度、提取温度、固液比及提取时间四因素作L9(34)正交实验，并对结果进行方差分析和显著性检验。

1.3.4 百合总皂苷的纯化

1.3.4.1 树脂预处理

将AB-8树脂用95%乙醇浸泡12 h后，湿法装柱，用95%乙醇4BV(4倍柱体积)动态清洗，再用水洗至无醇味;然后依次用5%盐酸(浸泡3 h后，3BV清洗，水洗至中性)和5%NaOH(浸泡3 h后，3BV清洗，然后水洗至中性)处理;最后用95%乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合(1∶5)不呈白色混浊为止;用水洗至无醇味，备用。

1.3.4.2 树脂的吸附和解吸

将已预处理AB-8大孔树脂装入柱中，将按最佳工艺提取的皂苷粗提液上柱至接近饱和。用蒸馏水洗至流出液为无色，后改用80%乙醇解吸，得解吸液。

1.3.4.3 产品的处理

解吸液真空干燥至恒重。按“1.3.2”项下方法操作，测定紫外吸光度，计算解吸液中总皂苷化合物的含量。按下式计算皂苷的纯度:总皂苷的纯度= (W/Wo)×100%式中，W为解吸液中皂苷的含量(mg);Wo为解吸液干燥后的重量(mg)。纯化后皂苷的纯度见表5。

1.3.5 抗抑郁活性的测定方法

1.3.5.1 小鼠悬尾实验［9］

给药7 d后将小鼠悬于悬尾装置(铁架台)，具体操作:用医用胶布粘在小鼠尾部距尾尖1 cm处，距桌面15 cm处，让小鼠预适应1 min，记录5 min内小鼠的不动时间。

1.3.5.2 小鼠强迫游泳实验［10］

小鼠游泳绝望将小鼠放入水深10 cm、直径20 cm的桶内，水温保持在25℃。小鼠在初放入水桶内时，拼命游泳并试图爬上桶壁，一段时间后，小鼠因失望而活动减弱，活动之间有较长时间的不动间歇，表现为身体微曲，保持垂直姿势，鼻孔露出水面，并且间歇时间越来越长。末次给药1 h后，将小鼠放入桶内，预适应2 min，记录后5 min内的不动时间。

1.3.6 百合总皂苷的活性测试

根据参考文献［11］，百合约30 g，按照人体表面积换算，小鼠约为60 kg体重成人用量的10倍。该剂量设为中剂量，大剂量为中剂量的2倍，小剂量为中剂量的1/2倍。阳性药氟西汀4 mg/kg，为60 kg体重成人日用量的20倍。百合皂苷大剂量为0.13 g皂苷/kg。

1.3.7 统计学处理

实验数据采用SPSS11.0软件处理分析，组间差异采用t检验，P＜0.05被认为有统计学显著差异。

2 结果与分析

2.1 百合总皂苷的定量测定

2.1.1 标准溶液和标准曲线的测定

薯蓣皂苷对照品经香草醛-高氯酸显色后于TU-1901双光束紫外可见分光光度计上作最佳吸收波长扫描并绘制扫描曲线，显色后，反应产物在535 nm处有最大吸收且反应2 h内其吸光度保持稳定。

精密吸取薯蓣皂苷对照品溶液(浓度为0.10 mg/L)0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，置10 mL西林瓶中，低温烘干溶剂，冷却，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，再加入高氯酸0.7 mL，混匀，置于60水浴20 min，取出，迅速冷却。精密加入冰醋酸液5 mL，摇匀，在暗处放置30 min，在535 nm波长处测定吸光度。随行空白。以薯蓣皂苷对照品取样量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程为Y=6.4391X+0.0171，r=0.9994(n=8)。结果表明，薯蓣皂苷在0.04～0.16 mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.2 百合总皂苷的提取率测定

称取30.0 mg按各工艺制备的浸膏，溶于甲醇并定容至100 mL，测定其百合总皂苷的提取率，结果见表2。

2.2 正交实验的设计及结果

［12］，用乙醇为溶剂提取的四因素、三水平正交实验，因素水平见表1，结果见表2，对表中皂苷提取率进行方差分析和显著性实验，结果见表3。

通过比较各因素的极差值R可以看出，影响总皂苷的因素顺序为D＞A＞B＞C，得到最佳提取条件为A2B3C3D3，具体见表2。从表3可以看出，乙醇浓度、提取次数和时间对总皂苷的提取有显著性影响，并考虑百合总皂苷的提取率和实际生产情况，最终确定的最佳提取条件为:D3A2B3C3，即用10倍于药材的乙醇(浓度为80%)，加热回流3 h提取百合总皂苷，提取次数为3次。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

表2 L9(34)正交试验结果Table 2 Result analysis of orthogonal test［L9(34))］

9 3 3 2 1 0.51 k12.59 2.07 2.31 1.70 k22.62 2.20 2.29 2.43 k31.81 2.75 2.42 2.89 K10.86 0.69 0.77 0.57 K20.87 0.73 0.76 0.81 K30.60 0.92 0.81 0.96 R 0.27 0.23 0.05 0.39

表3 正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal design

2.3 最佳提取工艺的验证

精密称取3份干燥的百合鳞茎20 g，按最佳工艺条件平行操作，按照“1.3.2”项下的方法测定吸光度，根据回归方程得出总皂苷的含量。验证试验结果详见表4。

表4 最佳工艺验证试验结果Table 4 Result of verification test

由表4可知，根据最佳工艺条件提取，提取物总皂苷含量均高于其它各正交试验值，RSD=2.48% (n=3)，结果表明，此工艺重现性好。

表5 纯化后总皂苷的含量(n=3)Table 5 The content of total saponins after purification by AB-8 macroporous resin(n=3)

2.4 百合总皂苷抗抑郁活性研究

百合总皂苷中剂量、小剂量能明显缩短小鼠悬尾的不动时间和游泳时间(P＜0.05或者P＜0.01)，这说明百合总皂苷具有较好的抗抑郁活性。具体结果见表6和表7。

3 结论

3.1 过正交实验，选出最佳工艺:提取时间为3 h，

表6 百合总皂苷对小鼠悬尾实验的影响Table 6 Aralia elata Lily saponins on the impact of mouse tail suspension test

m乙醇体积分数为80%，固液比为1∶10，提取次数为3次。正交试验的方差分析表明，提取时间、提取次数和乙醇的浓度是影响提取效果的显著因素。因此，提取过程中要注意控制提取时间和乙醇的浓度。

3.2 使用大孔树脂操作简单，成本低廉，对粗总皂苷纯化效果显著，有较高的工业生产应用价值。经过AB-8大孔树脂富集纯化总皂苷的含量达到62%以上。

3.3 抗抑郁活性实验表明:百合总皂苷中剂量、小剂量能明显缩短小鼠悬尾的不动时间和游泳时间，表现出好的抗抑郁活性。

表7 百合总皂苷对小鼠强迫游泳实验的影响Table 7 The effects of forced swimming test of mice in Aralia elata Lily saponins

参考文献

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Extraction and Purification Techniques and Antidepression Activity of Total Saponins from Bulbs of Lilium brownii

FU Chun-yan1*，LIU Yong-hui2，LI Ming-juan1，WANG Xiao-hui1，YIN Wen-qing3

1Department of Pharmacy，Shaoyang Junior Medicine College;2Red Cross Hospital at Xinshao County of Hunan Province，Shaoyang 422000，China;3Key Laboratory for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources，Ministry of Education of China，College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China

Extraction and purification techniques of total saponins from bulbs ofLilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker.and the antidepressant activity of the total saponins were studied in this paper.Based on orthogonal design，four factors in extraction of saponins from bulbs ofLilium browniewere optimized:concentration of ethanol，reflux time，solid/liquid ratio and extraction times.The optimized process for extracting total saponins from bulbs ofLilium browniiwas confirmed as follows:reflux time，3 h;alcohol，80%;solid/liquid，1∶10;extraction 3 times.The highest extraction rate reaches 1.24%.Then，the extract of total saponins was separated and purified by AB-8 porous resin absorption and the total saponins content reaching 62%.In antidpression effect filtration study，the mouse tail suspended experiment，mouse forced swimming experiment were performed，the result showed that the total saponins was the main antidepression component.The above results showed that the total saponins had certain antidepressant activity.

total saponins;Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker.;extracting process;antidepression

R914

A

1001-6880(2012)05-0682-05

2011-05-17 接受日期:2011-11-15

湖南省教育厅科研基金项目(10C0294)

*通讯作者 Tel:86-013762850152;E-mail:Chunyanfull@yahoo.com.cn