椰子种皮油提取物对低密度脂蛋白氧化的抑制作用

赵晓莉，陈卫军，赵松林，张春梅，王 妨

1中国热带农业科学院椰子研究所产品加工研究室，文昌 571339;2海南大学食品学院，海口 570228

椰子种皮油提取物对低密度脂蛋白氧化的抑制作用

赵晓莉1，2，陈卫军1*，赵松林1，张春梅1，王 妨2

1中国热带农业科学院椰子研究所产品加工研究室，文昌 571339;2海南大学食品学院，海口 570228

本文研究了椰子种皮油提取物对低密度脂蛋白氧化的抑制作用，以水溶性VE(Trolox)作为对照，测定椰子种皮油提取物的总酚含量，总抗氧化能力，检测提取物对低密度脂蛋白的氧化易感性，硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)值及铜络合能力的影响。结果表明，椰子种皮油提取物的总酚含量为68.6 mg/g，总抗氧化能力也随着浓度增大而加强，说明该提取物具有较好的抗氧化活性。浓度为0.5 mg/mL的提取物能将低密度脂蛋白的延滞时间延长了两倍，丙二醛(MDA)含量也明显下降，表明椰子种皮油提取物对低密度脂蛋白的氧化具有一定的抑制作用。

椰子种皮油提取物;低密度脂蛋白;TBARS;脂质过氧化;铜络合

低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)是人体血浆中携带大量胆固醇的主要蛋白质，也含有大量亚油酸和花生四烯酸等不饱和脂肪酸，这些成分极易氧化变性而成为过氧化物，氧化LDL不再能结合到LDL受体上，而是与巨噬细胞的清除受体相结合，并形成泡沫细胞，是导致动脉粥样硬化的主要原因［1-3］。因此，如何抑制LDL的氧化，成了目前研究的热门课题。

椰子种皮(coconut testa)是椰子硬壳内椰肉上附着的一层薄皮，成熟时呈黑褐色，一般作为椰子加工过程中的副产物。种皮中也含有一定量的油脂，但椰子种皮油(coconut testa oil)一般作为工业用油，经济效益较低，但是据文献报道，带种皮的椰子油中富含多酚及其他活性物质［4］。本文主要是体外利用Cu2+诱导LDL氧化，研究了椰子种皮油提取物(coconut testa oil extracts)对LDL氧化的抑制作用，为椰子种皮油的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

椰子种皮，自制，椰子采自于中国热带农业科学院实验基地。

LDL、水溶性维生素E(6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid，Trolox)、福林酚试剂购于美国Sigma公司。

甲醇(西陇化工股份有限公司);异丙醇、氯化铜、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(广州化学试剂厂);三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)(天津福辰化学试剂厂);2-硫代巴比妥酸(2-Thiobarbituric acid，TBA)和二乙烯三胺五乙酸(Diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)(国药集团化学试剂有限公司)。T-AOC总抗氧化能力试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。

UVLINE9400紫外可见分光光度计，BECKMAN高速冷冻离心机，超声波清洗仪，恒温水浴锅，R-210旋转蒸发仪。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

1.2.1.1 椰子种皮油(CTO)的制备

新鲜椰子种皮，烘干，打碎，取种皮50 g，加入200 mL异丙醇，60℃，超声波辅助提取3 h，真空抽滤，旋转蒸发除去溶剂，即得椰子种皮油。

1.2.1.2 椰子种皮油提取物(CTOE)的制备

［5］的方法，略加改进。取椰子种皮油50 g，加入10 mL 80%甲醇(甲醇/水，v:v，8∶2)，超声波辅助提取10 min，然后离心，2000×g，30 min，收集上层清液，重复提取三次，合并清液，40℃旋转蒸发，除去甲醇，然后冷冻干燥。总酚含量采用福林-酚法测定，提取物的总酚含量为68.6 mg/g。

1.2.2 提取物抑制LDL氧化能力的测定

1.2.2.1 铜诱导LDL氧化(氧化动力学)

参考文献［6］的方法，略加改进。用10 mM pH 7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)将LDL浓度稀释至100 μg/mL。取该浓度的LDL 100 μL，加入同体积浓度为0.5 mg/mL提取物/Trolox，混匀，于37℃水浴中水浴30 min，然后加入50 μL浓度为50 μM的CuCl2，用10 mM pH 7.4的PBS补充体积至1 mL，于234 nm处测试吸光值，每2 min读数一次，共扫描8 h。浓度为1.0、1.5、2.0和2.5 mg/mL的提取物及Trolox，也分别按照上面的步骤，每个浓度3个平行，以不加提取物的组作为空白。

1.2.2.2 TBARS的测定

本实验通过测定硫代巴比妥酸反应物(TBARS)来评定LDL脂质过氧化程度。参考文献［7］，并加以改进。取100 μg/mL的LDL100 μL，加入同体积的各浓度的提取物/Trolox，37℃水浴30 min后，加入50 mM的CuCl250 μL，再置于37℃水浴反应10 h后，加入1 mL 20%的三氯乙酸(TCA)，1 mL 1%的硫代巴比妥酸(TBA)，沸水浴30 min，冷却后于532 nm处测吸光值，以不加TBA作为空白。

1.2.3 提取物与铜络合能力测定

1 mL各浓度的提取物，加入250 μL 5 mM的CuCl2，37℃水浴30 min，再加入1 mL 10 mM的DTPA，做全波长扫描，从190 nm到850 nm，以不加DTPA作为空白［6］。

1.2.4 提取物总抗氧化能力的测定

本实验采用铁离子还原法(ferric reducing/antioxidant power assay，FRAP)测定总抗氧化能力，Fe3+-吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ)可被样品中的还原物质还原为Fe2+，呈现出蓝色，并于593 nm处有最大吸收，根据吸光度的大小计算样品抗氧化活性的强弱。本次实验采用总抗氧化能力试剂盒，浓度梯度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，取样量为0.1 mL。

总抗氧化能力=［(ODU-ODC)/0.01］÷30×N

O DU——测定管吸光度值

O DC——对照管吸光度值

N——反应体系稀释倍数(反应液总体积/取样量)

1.3 数据分析

所有的数据均用Excel和SPSS11.5软件处理，差异显著性水平为P＜0.05，平均数之间的多重比较使用邓肯新复极差检验方法(DMRT)。

2 结果

2.1 椰子种皮油提取物对LDL氧化易感性的影响

图1 椰子种皮油提取物对LDL氧化过程中共轭二烯形成的影响示意图Fig.1 Influence of CTOE on copper-induced formation of conjugated dienes(CD)in LDL

对Cu2+诱导的LDL氧化过程进行了8 h的扫描。LDL中的多不饱和脂肪酸容易被氧化，氧化后形成共轭二烯(conjugated dienes，CD)，CD在紫外区有吸收，在波长234 nm处有最大吸收峰，脂质过氧化程度越高，其吸光度数值越大，因此CD值可以作为判断LDL氧化的指标［8］。按CD产生的量随时间变化来绘制LDL氧化曲线，如下图，从样品开始被氧化到过氧化反应加速这个阶段被称为延滞期，延滞阶段与增殖阶段的切线交点所对应的X轴的时间值就是延滞时间［9］，如图1所示。通过对比模型的延滞时间来判断样品的抗脂质过氧化能力。

结果如表1所示，相同条件下，100 μL 0.5 mg/ mL的提取物加入后，延滞时间延长至40 min，明显延缓LDL氧化，而且随着样品浓度的增大，其延滞时间越来越长，说明其抑制LDL氧化的能力随着浓度增大而加强，但效果略低于Trolox。

表1 椰子种皮油提取物对LDL氧化滞后时间的长短的影响(n=3，±s)Table 1 The effect of CTOE on lag time in the oxidation process of LDL(n=3，±s)

表1 椰子种皮油提取物对LDL氧化滞后时间的长短的影响(n=3，±s)Table 1 The effect of CTOE on lag time in the oxidation process of LDL(n=3，±s)

注:同一列中字母不同表示差异显著(P＜0.05)Note:In the same column，the different letter means significant difference (P＜0.05)

组别Group浓度(mg/mL) Concentration延滞时间(min) Lag time空白组Blank group 0 19±2.08k0.5 40±2.52j样品组Sample group 1.0 92±1.15h1.5 157±2.08f2.0 230±1.53d2.5 284±2.08b0.5 50±2.65i对照组Control group 1.0 136±1.53g1.5 189±2.08e2.0 217±2.08c2.5 276±2.08a

图2 椰子种皮油提取物对LDL氧化过程中TBARS产物的抑制作用Fig.2 nhibitory effect of CTOE on production of TBARS in Cu2+-mediated oxidation of LDL

2.2 椰子种皮油提取物对LDL脂质过氧化程度的影响

A532的值大小表明MDA的含量多少，从表2可以看出，在37℃下反应10 h后，在氧化体系中加入样品后，从0.5 mg/mL到2.5 mg/mL，其吸光值越来越小，表明生成的MDA越来越少，说明椰子种皮油提取物对于LDL氧化的抑制呈剂量依赖性，与抑制LDL氧化动力学实验呈现的趋势相同。

2.3 提取物铜络合能力

提取物与铜离子络合后，加入DTPA络合剩余的铜离子，从图3可以看出，Cu2+与DTPA的络合物在287 nm附近有最大吸收，因为酚类化合物在280 nm之前有吸收但低于最大吸收峰，所以250 nm之前混合物的吸收图谱未呈现在图3中。

图3 提取物与Cu2+络合能力Fig.3 The copper chelating capacities of CTOE

图3呈现的是从250 nm到340 nm的吸光值，据文献报道［6］，Cu2+与DETAPAC(二乙烯三胺五乙酸酐)络合物在650 nm附近有最大吸收峰，但本实验中并没有发现。吸收峰值越大，表明Cu2+与DTPA的络合物越多，即提取物络合能力越弱。结果如图3所示，由上往下依次是Cu2+，0.5 mg/mL提取物，1.0 mg/mL提取物，1.5 mg/mL提取物，2.0 mg/ mL提取物，2.5 mg/mL提取物与DTPA络合物扫描结果，可以看出峰值越来越小，说明随着浓度的增大，提取物与铜离子的络合能力越强，表明抑制由Cu2+诱导的LDL氧化的能力越强。

2.4 提取物总抗氧化能力

FRAP法是一种简单易操作的测定总抗氧化能力的方法，用来测定在抗氧化剂存在下对Fe3+还原为Fe2+的影响［12，13］。从图4可以看出，样品浓度越大，抗氧化能力越强。

图4 FRAP法测得椰子种皮油提取物总抗氧化能力Fig.4 The total antioxidant capacity of CTOE measured by FRAP assay

3 讨论

诸多研究表明，LDL的氧化变性是动脉粥样硬化初期病变的重要因素。活性氧和自由基是一种因失去一个电子而形成的不对称、不稳定的原子和分子，具有很大的能量，以攻击细胞组织中的脂质，蛋白质，糖类和DNA等物质，企图夺取一个电子以求得重新平衡，这就造成了脂质和糖类的氧化、蛋白质的变性、酶的失活、DNA结构的切断或碱基变化等种种改变，从而导致细胞膜、遗传因子等的损伤，因而引发种种疾病、癌变、老化等［14］。植物多酚能够有效清除人体内过剩的自由基，如能够阻止活性氧引起的生物大分子(如脂类、蛋白质等)的氧化损伤，且对由自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用［9］。

据文献［4］报道，用带有种皮的椰肉提取的椰子油中的多酚类物质及其他活性物质要比只用白椰肉提取的椰子油中含量高出许多，如没食子酸，儿茶素，表儿茶素含量比较高等，说明椰子种皮中也含有丰富的多酚类物质。但是对于只用椰子种皮提取的油脂的研究，目前还没未见有报道。本文研究结果表明椰子种皮油提取物具有较好的抗氧化活性和对Cu2+诱导的LDL氧化的抑制作用。保护作用的机制可能是提取物中含有的多酚类化合物清除氧自由基、阻断过氧化链式反应、螯合游离的Cu2+［10］、生成络合物、减少金属离子催化的LDL的氧化等。但这些假设还需要鉴定提取物的成分以后才能确定。椰子种皮油提取物具有较强的抗氧化活性，可以提高椰子种皮油的利用价值，提高椰子加工副产物的利用率。

参考文献

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Inhibition of Coconut Testa Oil Extracts on Human Low-density Lipoprotein Oxidation

ZHAO Xiao-li1，2，CHEN Wei-jun1*，ZHAO Song-lin1，ZHANG Chun-mei1，WANG Fang2

1Coconut Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Wenchang 571339，China;2College of Food，Hainan University，Haikou 570228，China

The inhibition activity of coconut testa oil extracts on human low density lipoprotein(LDL)was investigated by comparing with Trolox.Assays of copper-mediated LDL oxidation，thiobarbituric acid-reactive substances(TBARS) formation，total antioxidant capacity，total phenolic content and Cu2+binding studies were carried out in this paper.The results showed that the extracts of coconut testa oil had the evident inhibition effect on low density lipoprotein oxidation.The total phenolic content was 68.6 mg/100 g.And 100 μL extract at 0.5 mg/mL could increase the lag time to 41 min，but evidently decrease the value of TBARS.

coconut testa oil extracts;LDL;TBARS;lipid peroxidation;Cu2+binding

TS222+.1

A

1001-6880(2012)05-0668-04

2011-06-08 接受日期:2011-11-03

公益性行业(农业)科研专项经费项目(200903026-3);海南省社会发展科技专项(2010SF006)

*通讯作者 E-mail:xachenweijun@yahoo.com.cn