11-脱氧18α-和18β-甘草次酸类抗癌复合物的制备和结构表征

木合布力·阿布力孜，闵 杰，郑大成，马红艳，热娜·卡斯木

新疆医科大学药学院药物化学有机教研室，乌鲁木齐 830011

11-脱氧18α-和18β-甘草次酸类抗癌复合物的制备和结构表征

木合布力·阿布力孜，闵 杰，郑大成，马红艳，热娜·卡斯木*

新疆医科大学药学院药物化学有机教研室，乌鲁木齐 830011

为寻找新型肝靶向抗癌前药，将具有肝靶向特征的天然分子甘草次酸的半合成衍生物与抗癌药环磷酰胺的活性代谢物氮芥磷酰二氯偶联制成11-脱氧甘草次酸类两个目标化合物和7个中间体。化合物的化学结构用常规光谱分析法进行鉴定，对合成工艺、理化性质和光谱特征进行系统描述。本研究对甘草次酸类新型肝靶向抗癌前药的药理活性筛选奠定基础。

11-脱氧甘草次酸类;氢化还原;构型转化;11-脱氧18α-和18β-甘甲磷酰氮芥酯;结构表征

靶向前药在提高化疗药物在癌组织中的局部浓度，降低全身性毒副作用以及降低耐药性方面具有明显优势，从而成为新型抗癌药物研究热点［1］。中药甘草(Glycyrrhiza inflata)有效成分甘草甜素的苷元甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)具有较强的抗氧化和保肝活性［2，3］，同时具有良好的肝组织分布特征和肝细胞靶向性［4-6］，并促进癌肝癌细胞凋亡［7］。这些研究结果显示，甘草次酸及其衍生物具有作为运载肝病治疗药物的肝靶向载体使用的潜力，与抗癌药物偶联成肝靶向前药，在新型靶向抗癌药物的设计和研究中具有较好的前景。目前，甘草次酸的假醛固酮增多症副作用限制它的广泛药用［8］，研究表明，在甘草次酸分子结构中，消除C11-位上氧原子的衍生物无此副作用［9，10］。

本文作者在前期研究的基础上［2］，利用甘草次酸的肝靶向性、抗氧化保肝作用和促进肝癌细胞凋亡等特点，以甘草次酸为起点，经化学修饰获得其11-脱氧的衍生物，再将它做为肝靶向化学载体，与抗癌药物环磷酰胺的活性代谢产物——氮芥磷酰二氯相连接，制成具有肝靶向潜能的抗癌前药复合物。作为载体的甘草次酸具有两种光学异构体，其中18α-甘草酸的肝组织分布能力比18β-甘草酸要更强［5］，但18α-体的天然来源非常有限，植物中含量甚微。因此，本研究中先对18β-甘草次酸进行构型转化，制成其光学异构体18α-甘草次酸，再合成了相关目标化合物。关于两个目标化合物的结构信息未见文献报道。本文对各化合物的理化性质和光谱特征进行系统研究并详细描述，以便为深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

定性鉴别用 TLC板(Silica gel 60 F254，MERCK)，制备型 TLC板(Silica gel 60 F254，MERCK)，WRS-1A型数字式熔点测定仪，核磁共振仪(1H NMR，Varian-600，CDCl3)，红外光谱仪(IR，MERCK，样品用KBr压片)，UV仪(UV Kontron);质谱仪(MS quadripolar VG Platform II)。

18β-甘草次酸和18α-甘草次酸标准品(98%，Acros Organic，France)，18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid，新疆天山制药有限公司提供)，其它化学试剂均为分析纯。

1.2 合成方法

化合物的合成方法见图1。以18β-甘草次酸(I)为起始化合物，经锌粉盐酸还原得11-脱氧18β-甘草次酸(II)，经甲酯化反应的化合物III，经I的C18位β-氢的构型转化获得光学异构体18α-甘草次酸(IV);经同法还原和甲酯化得11-脱氧18α-甘草次酸(V)及其甲酯(VI);将III和VI分别与抗癌药环磷酰胺的活性代谢产物氮芥磷酰二氯(VII)偶联，获得两个目标化合物11-脱氧18α-和11-脱氧18β-甘草次酸甲磷酰氮芥酯(VIII和IX)。结构均以1H NMR、IR、MS和UV等常规方法进行鉴定。

图1 甘草次酸衍生物的合成路线Fig.1 Synthesis pathway of glycyrrhetinic acid derivatives

化合物II的制备:将18β-甘草次酸(I)0.45 g溶于无水乙醇100 mL中，加入锌粉9.0 g，加热回流，1 h内滴入盐酸80 mL，并滴加无水乙醇至反应液澄清，继续回流2 h，过滤，滤液中加蒸馏水至出现沉淀，水浴加热至沉淀完全溶解，4℃放置24 h后抽滤，得白色粗品沉淀，用甲醇重结晶，得精品0.28 g，产率62%。

化合物III、IV和V的制备:III、IV和V均按照我们前期发表论文［11］中的方法进行制备，产率分别为28%、45%和25%。

化合物VII的制备:VII(氮芥磷酰二氯，nitrogen mustard dichlorophosphate，简称 DCPNM)按文献［12］的方法，将二乙醇胺与三氯氧磷反应而获得，产率32%。

化合物VIII的制备:取50 mL的三口圆底烧瓶，加入化合物IV 2.00 g和V 1.4 g，溶解于20 mL无水氯仿中，加入5 mL无水吡啶，加温回流3～4 h，用TCL检测反应进程。将产物用50 mL氯仿萃取三次，用无水MgSO4干燥，减压蒸除氯仿，粗品用硅胶柱层析进行分离纯化(乙酸乙酯/石油醚)，并用石油醚(bp90-120℃)和丙酮混合液重结晶得精品，产率23%。

化合物IX的制备:IX按以上方法(同VIII)进行制备，产率28%。

此外，经简单的因素分析经验，对以上两种目标化合物的制备工艺进行考察，并发现磷酰酯化反应条件应控制为无水条件、配料比1∶1.35、65℃/3-4 h，此时反应稳定进行，产率较高，经TLC检测的副反应发生率低。

2 结果

18β-甘草次酸(I):3β-hydroxy-11-oxo-18β-olean-12-en-30-oic，白色粉末状晶体，难溶于水，溶于乙醇，易溶于氯仿、热甲醇和热乙醇，微溶于丙酮。mp 296～298℃ (EtOH)，+135(c 1.0，EtOH); IR(KBr)νmax3440，3046，2943，1666，1018 cm-1;1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.83(3H，s，H-28)，0.86 (3H，s，H-24)，1.03(3H，s，H-26)，1.15(3H，s，H-23)，1.16(3H，s，H-25)，1.25(3H，s，H-29)，1.39 (3H，s，H-27)，2.37(1H，s，H-9)，2.81(2H，dt，J= 3.2，13.6 Hz，H-1)，3.26(1H，dd，J=5.8，10.8 Hz，H-3)，5.73(1H，s，H-12).EI-MS(neg.)m/z:470.7［M］+。以上数据与我们前期发表论文一致［13］。

11-脱氧-18β-甘草次酸(II):3β-hydroxy-18βolean-12-en-30-oic，白色针状结晶，溶于热甲醇和氯仿，二氯甲烷，微溶于无水乙醇和乙酸乙酯，不溶于水，mp 328.1-330.6℃;IR(KBr)νmax3439，2974，2926，2876，1707，1383，1366 cm-1(1666 cm-1处共扼碳基峰消失);1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.76 (3H，s，28-H)，0.77(3H，s，23-H)，0.96(3H，s，25-H)，0.97(3H，s，26-H)，0.98(3H，s，24-H)，1.01(3H，s，29-H)，1.11(3H，s，27-H)，3.13( 1H，m，3-H)，5.24(1H，t，12-H)。EI-MS m/z: 456.7［M］+。以上数据与文献［14］报道一致。

11-脱氧-18β-甘草次酸甲酯(III):30-methyl-3βhydroxy-18β-olean-12-en-30-oic，白色针状结晶，溶于热甲醇、氯仿，微溶于无水乙醇和乙酸乙酯，不溶于水，mp 292.1-294℃;+124(c 1.0，EtOH); IR(KBr)νmax3 352，2943，1722，1466，1387，1323，1215，1159 cm-1;1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.74～1.35(21H，m，7×CH3)，2.02(3H，s，CH3CO)，4.60(1H，t，J=9.0 Hz，H-3)，5.24(1H，s，Δ12-H); EI-MS m/z:470.71［M］+。1H NMR谱图中出现了δ =3.67 ppm的甲氧基峰，而δ=12 ppm的羧基峰消失。IR谱图1220 cm-1左右处出现酯基的VC-O-C中强吸收带。综合上述分析，并结合文献［14］数据，鉴定其为11-脱氧-18β-甘草次酸甲酯。

18α-甘草次酸(IV):3β-hydroxy-11-oxo-18αolean-12-en-30-oic，易溶于氯仿、热甲醇和热乙醇，微溶于丙酮，不溶于水。mp 330.8～331.2℃(文献值330-335℃［15］)，+74.5(c 1.0，EtOH)，产率45% (文献值 20%［15］);IR(KBr)νmax3496，2969，2926，2867，1704，1661，1297，1200，1112，1028，989，658 cm-1.1H NMR(DMSO-d6，600 MHz) δ:0.64-0.68(m，H-7，H-5，H-24，H-28)，0.89(s，3H，H-23)，0.93-0.99(m，1H，H-1)，1.03(s，3H，H-26)，1.08(s，3H，H-25)，1.15(s，3H，H-29)，1.43(m，2-H，H-22)，1.46(m，2-H，H-19)，1.47 (m，2H，H-16)，1.49(m，2H，H-15)，1.51(m，2H，H-7)，1.56(m，2H，H-6)，1.62(m，2H，H-2)，1.66 (m，H-2，H-21)，1.77(dt，J=13.8，3.6 Hz，1H，H-21)，1.88(dt，J=13.3，3.8 Hz，1H，H-15)，2.25～2.28(m，2H，H-9，H-18)，2.45(d，J=13.3 Hz，1H，H-1)，3.00(dd，J=10.8，3.5 Hz，1H，H-3)，5.32 (s，1H，H-12);EI-MS m/z:470.7［M］+。以上数据与文献［15］相符。

11-脱氧-18α-甘草次酸(V):3β-hydroxy-18αolean-12-en-30-oic，白色针状结晶，溶于热甲醇和氯仿，二氯甲烷，微溶于无水乙醇和乙酸乙酯，不溶于水，mp 328.1～330.6℃;IR(KBr)νmax:3439，2974，2926，2876，1707，1383，1366(齐墩果烷型五环三萜骨架A区的两特征峰)，1308，1217，1177(齐墩果烷型五环三萜骨架 B区的三特征峰)cm-1，1666 cm-1处共扼碳基峰消失;1H NMR(CDCl3，600 MHz) δ:0.66(3H，s，H-28)，0.74(3H，s，H-23)，0.85 (3H，s，H-25)，0.88(3H，s，H-26)，0.93(3H，s，H-24)，1.01(3H，s，H-29)，1.11(3H，s，H-27)，3.13 (1H，m，H-3)，5.17(1H，s，H-12);EI-MS m/z:456.7［M］+。以上特征与文献报道［15］的相符。

11-脱氧-18α-甘草次酸甲酯(VI):30-methyl-3β-hydroxy-18β-olean-12-en-30-oic，白色针状结晶，溶于热甲醇、二氯甲烷和氯仿，微溶于无水乙醇和乙酸乙酯，不溶于水，mp 292.1-294℃，+74.5 (c 1.0，EtOH);IR(KBr)νmax2940，1720，1700，1460，1370，1245，1215，1150 cm-1，IR谱图1220 cm-1左右处出现酯基的 νC-O-C中强吸收带。1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:0.71～1.36(21H，m，7× CH3);2.11(3H，s，CH3CO);4.16(1H，t，J=9Hz，C3-H);5.18(1H，s，Δ12-H)，1H NMR谱图中出现了δ=3.685 ppm的甲氧基峰，而δ=12.18 ppm的羧基峰消失。EI-MS m/z:470.7［M］+.综合上述分析，并结合文献［15］数据鉴定为11-脱氧-18α-甘草次酸甲酯。

氮芥磷酰二氯(VII):nitrogen mustard dichlorophosphorous(DCPNM)，无色片状结晶，质重，有光泽。易溶于乙醇和丙酮，微溶于石油醚。熔点:mp 51～53℃;IR(KBr)νmax:2960，1361，1199，1116，983，891，777，555 cm-1;1H NMR(acetone-d6，600 MHz)δ:3.74～3.77(4H，t，J=13.2 Hz，2×-CH2N)，3.89(4H，t，J=12.6 Hz，2×-CH2Cl2);EIMS m/z:［M］+258.9;以上特征与文献值相符［12］。

11-脱氧-18α-甘草次酸甲酯-磷酰氮芥酯(VIII):又名N，N-二(氯乙基)-3β-O-18α-甘草亭酸甲酯基磷酰胺单酯，为白色粉末，溶于氯仿，乙酸乙酯，石油醚和甲醇，mp 137.6～141.2℃;IR(KBr)νmax: 2972，1728，1660，1454，1280，1193，1112，983 cm-1;1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.70(3H，s，H-23)，0.86-0.87(7H，m，H-5，H-24，H-28)，1.04 (3H，s，H-26)，1.12(3H，s，H-25)，1.20(3H，s，H-29)，1.21-1.62(17H，m，H-2，H-6，H-7，H-15，H-16，H-19，H-22，H-27)，1.90(1H，m，H-15)，2.01(1H，m，H-21)，2.13(1H，m，H-18)，2.24(1H，m，H-9)，3.41(4H，t，J=9.6 Hz，2×-CH2N)，3.56(4H，t，J= 12.6 Hz，2×-CH2Cl2)3.69(3H，s，-COOCH3)，4.82 (1H，s，-O-CH)，5.56(1H，s，H-12);EI-MS m/z:［M］+674.6。

IR谱图中除了存在18α-甘草次酸甲酯的1660 cm-1的吸收峰和1728 cm-1的酯基吸收峰两个特征峰外，还出现了2972 cm-1处的-P-OH吸收峰，1193 cm-1处的P=O吸收峰，1123 cm-1处的P-O-C吸收峰和 983 cm-1处的 P-N吸收峰。此外，在1H NMR谱图中，除了出现18α-甘草次酸甲酯的δ= 3.37 ppm的甲氧基信号峰外，还出现了 δ=3.41 ppm和δ=3.56 ppm的-CH2N和-CH2Cl2信号峰。综合上述分析，结合该结构的理化性质特征，鉴定为11-脱氧-18α-甘草次酸甲酯-磷酰氮芥酯。

11-脱氧-18β-甘草次酸甲酯-磷酰氮芥酯(IX):又名N，N-二(氯乙基)-3β-O-18β-甘草亭酸甲酯基磷酰胺单酯，为白色粉末，溶于氯仿，乙酸乙酯，石油醚和甲醇，mp 168.4～171.2℃;IR(KΒr)νmax: 2951，1732，1660，1386，1282，1213，1153，983 cm-1;1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:0.77(3H，m，28-H)，0.80(3H，s，H-23)，0.83(3H，m，24-H)，0.85 (1H，m，5-H)，1.05(3H，s，26-H)，1.03-1.08(1H，m，1-H)，1.09(3H，s，25-H)，1.15(3H，s，29-H)，1.26-1.66(17H，m，2-H，6-H，7-H，15-H，16-H，19-H，22-H，27-H)，1.81(1-H，m，21-H)，1.87(1H，m，15-H)，1.92(1-H，m，18-H)，1.95(1H，m，9-H)，3.37(3H，s，-COOCH3)，4.21(1H，s，-O-CH)，5.66 (1H，s，H-12);EI-MS m/z:［M］+674.6。

IR谱图中除了存在18β-甘草次酸甲酯的1660 cm-1的吸收峰和1732 cm-1的酯基吸收峰两个特征峰外，还出现了2951 cm-1处的-P-OH吸收峰，1213 cm-1处的P=O吸收峰，1153 cm-1处的P-O-C吸收峰和983 cm-1处的 P-N吸收峰。此外，在1H NMR谱图中，除了出现18β-甘草次酸甲酯的 δ= 3.69 ppm的甲氧基信号峰外，还出现了 δ=3.42 ppm和δ=3.54 ppm的-CH2N和-CH2Cl2信号峰。综合上述分析，结合该结构的理化性质特征，鉴定为11-脱氧-18β-甘草次酸甲酯-二氯磷酰氮芥酯。

3 讨论

从天然产物中寻找与特定组织细胞具有亲和力的靶向载体在有效低毒的新型靶向抗癌药物设计研究中具有一定优势。人们曾利用内源性天然分子胆酸的肝细胞靶向特点，将抗癌化疗药物与之偶联制成一系列小分子肝靶向抗癌药物并投入临床使用，在肝癌的治疗中获得明显进展［1］。虽然胆酸的来源昂贵，然而此成果促使人们从天然产物中寻找小分子靶向载体，以促进新型肝靶向药物的设计和筛选研究。

本研究中，利用天然三萜类分子甘草次酸的肝靶向性和促进肝癌细胞凋亡的特征，以18β-甘草次酸为起点，经半合成制备其11-脱氧衍生物，同时对各光学异构体进行构型转化，再与抗癌药环磷酰胺的活性代谢产物——氮芥磷酰二氯偶连而获得目标化合物，并对各化合物的化学结构用常规光谱分析法进行鉴定，对制备工艺、理化性质和光谱特征进行系统描述，为将来的药理实验研究奠定基础。本文作者对甘草次酸衍生物及其与磷酰氮芥二氯偶联的衍生物所进行的初步药理实验结果显示，甘草次酸的构型转化及与抗癌基团偶联能显著提高抗癌活性。人类肝癌细胞Bel-7402对本类化合物显示良好的敏感性［16］。本研究在新型肝靶向抗癌新药的设计和深入研究中将有一定的参考价值。

1 Monica G，Maria C，Rocio I.R，et al.Relationship between tumor cell load and sensitivity to the cytostatic effect of two novel platinum-bile acid complexes，bamet-D3 and bamet-UD2.J Drug Targ，2002，10:397-404.

2 Ablise M，Leininger-Muller B，Wong CD，et al.Synthesis and in vitro antioxidant activity of glycyrrhetinic acid derivatives tested with the cytochrome P450/NADPH system.Chem Pharm Bull(Tokyo)，2004，52:1436-1439.

3 Hye GJ.Sung JP，Ae RM，et al.Hepatoprotective effects 18βglycyrrhetinic acid on carbon tetrachloride-induced liver injury:inhibition of cytochrome P450 2E1 expression.Pharm Res，2002，46:221-227.

4 Negishi M，Irie A，Nagata N，et al.Specific binding of glycyrrhetinic acid to the liver membrane.Biochim.Biophys Acta，1991，1066:77.

5 Fan Y(范益)，Ding JH(丁建花)，Liu SY(刘苏怡)，et al.Studies on distribution in mice tissues of α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid.Chin J Clin Pharm Ther(中国临床药理学与治疗学)，2004，9:619-622.

6 Cha RT(查瑞涛)，Du T(杜田)，Yuan Z(袁直).Syntheses and characterization of poly(γ-benzyl-L-glutamate)containing liver targeting group in main chain.Chem J Chin Univ(高等学校化学学报)，2006，27:885-887.

7 Huang W(黄炜)，Huang JQ(黄挤群)，Zhang DF(张东方)，et al.All-trans-retinoic acid，18β-glycyrrhetinic acid and glycyrrhizic acid induced differentiation and apoptosis of human hepatoma cells.Chin J Integ Trad West Medn Liv Dis(中西医结合肝病杂志)，2003，13:148-150.

8 Gaware R，Khunt R，Czollner L，et al.Synthesis of new glycyrrhetinic acid derived ring A azepanone，29-urea and 29-hydroxamic acid derivatives as selective 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2 inhibitors.Bioorg Med Chem，2011，19: 1866-1880.

9 Vicker N，Su X，Lawrence H，et al.A novel 18β-glycyrrhetinic acid analogue as a potent and selective inhibitor of 11βhydroxysteroid dehydrogenase 2.Bioorg Med Chem Lett，2004，114:3263-3267.

10 Su X，Lawrence H，Ganeshapillai D，et al.A novel 18β-glycyrrhetinic acid analogues as a potent and selective inhibitors of 11β-hydroxysteroid dehydrogenases.Bioorg Med Chem，2004，12:4439-4457.

11 Mourboul ABLISE(木合布力.阿布力孜)，Min J(闵杰)，Rena KASIMU(热娜.卡斯木)，et al.Preparation of 18αglycyrrhetinic acid and its methyl ester.Northwest Pharm J(西北药学杂志)，2009，24:58-59.

12 Li ZG(李在国).Organic Synthesis Intermediate Products.Chemical Industry Press(Beijing)(化学工业出版社)，2002，August，2nd Edition，p127，185.

13 Mourboul ABULIZI，Ma SY(马淑燕)，Rena KASIM，et al.Synthesis and in vitro antioxidant activity of homo and heterocyclic diene derivatives of glycyrrhetol.Acta Pharm Sin(药学学报).2008，43:719-722.

14 Xie SM(谢松梅)，Cui HF(崔慧斐)，Zang HC(臧恒昌).The preparation of deoxy-glycyrrhetinic acid.Chin J Biochem Pharm(中国生化药物杂志)，2007，28:74-76.

15 Ignatove DV，Prokofev IUL，Ipatova OM，et al.A simple method for preparation of 18 alpha-glycyrretinic acid ant its derivatives.Bioorg Khim.2003，29:429-33.

16 Mourboul ABLISE，Chang zhi DONG，Rena KASIM，et al.Synthesis and in vitro anticancer property of glycyrrhetinic acid derivatives towards human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402.47th International Conference of Medicinal Chemistry，2011，Jul 6-8，Lyon France(RICT 2011).

Preparation and Characterization of Anticancer Conjugates 11-deoxo-18α and 18β-Glycyrrhetinic Acid Derivatives

Mourboul ABLISE，MIN Jie，ZHENG Da-cheng，MA Hong-yan，Rena KASIM*
Department of Medicinal and Organic Chemistry，College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China

To obtain new anticancer prodrugs on the bases of hepatocell targeting property of natural product glycyrrhetinic acid and its semi-synthetic derivatives，we prepared two conjugated products by the route of coupling 11-deoxo-glycyrrhetinic acid derivatives with nitrogen mustard dichlorophosphate(the active metabolite of anticancer drug cyclophosphamide).The structure of two target compounds and 7 intermediate products was characterized by routine spectrometric methods;the technologies of preparation and physical-chemical properties were studied.This work may provide substantial bases for further pharmacological screening of new anticancer products from glycyrrhetinic acid derivatives with hepdirecting potency.

18β-glycyrrhetinic acid;chemical reduction;epimerization;11-deoxo-18α and 18β-methy glycyrrhetinic acidphosphorus nitrogen mustard ester;characterization

R284.2

A

1001-6880(2012)05-0648-05

2011-06-27 接受日期:2011-10-09

国家自然科学基金项目(30960461)

*通讯作者 Tel:86-991-4362473;E-mail:renakasimu@vip.sina.com