不同品种药用菊花中游离糖类及游离氨基酸含量的HPLC分析

高学玲，贺曼曼，邹敏亮，岳鹏翔，查芳芳

1安徽农业大学;2安徽食品安全分析与检测省级实验室，合肥 230036;3黄山天健农业科技有限公司，黄山 245700

不同品种药用菊花中游离糖类及游离氨基酸含量的HPLC分析

高学玲1，2*，贺曼曼1，2，邹敏亮3，岳鹏翔1，查芳芳1

1安徽农业大学;2安徽食品安全分析与检测省级实验室，合肥 230036;3黄山天健农业科技有限公司，黄山 245700

为比较不同品种菊花的品质特征，本文采用HPLC法测定其游离糖类及游离氨基酸的含量。结果表明，不同品种菊花中游离糖类主要成分是果糖和葡萄糖，蔗糖和麦芽糖未检出，总游离糖类含量约为9.07～18.76 g/100 g，其中黄山贡菊中含量最高，为18.76 g/100 g，黄菊中最低，为9.07 g/100 g;其总游离氨基酸含量约为0.563～2.806 g/100 g，七月菊中含量最高，为2.806 g/100 g，杭白菊中最低，为0.563 g/100 g。

菊花;游离糖类;游离氨基酸;含量测定

菊花(Flos chrysanthemi)为菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat)的头状花序，为多年生草本植物，味甘苦，性微寒，具有疏风清热，平肝明目，解毒消肿的功效，主治外感风热或风温初起，发热头痛，眩晕，目赤肿痛，疔疮肿痛等［1］。杭白菊，贡菊，亳菊和滁菊载入2010年中国药典第一部，可药用。菊花同时被卫生部列为既是食品又是药品的物品名单，在中国为仅次于茶叶和咖啡的第三大饮品。目前报道的文献关于菊花的研究主要集中在菊花中黄酮类化合物、绿原酸、挥发油等方面［2-5］，对于菊花中含量丰富的重要呈味成分及功能成分的游离糖类及游离氨基酸鲜有研究报道［6］。为了探讨不同品种药用菊花中游离糖类及游离氨基酸的分布状况，本文采用HPLC法对11个不同品种菊花中2种游离单糖、2种二糖及22种游离氨基酸进行了含量测定及分析比较，以期为菊花的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

贡菊、金贡菊、金香菊、野菊花均为2009年11月雅氏贡菊厂收集;七月菊为2009年10月黄山区焦村镇采摘;杭白菊、杭黄菊2009年12月购买于桐乡市春发杭白菊制品厂;亳菊于2009年12月购买于安徽九九通医药有限公司;滁菊于2009年12月购买于安徽滁州菊泰工贸;怀菊于2009年12月购买于河南焦作兴旺怀药贸易有限公司;祁菊于2009年12月购买于河北安国一方药材有限公司。所有样品均经鉴定，并留存于安徽农业大学茶与食品科技学院样品室。

1.2 仪器

Aglient 1200SL高效液相色谱;AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器);RUC-5200型超声波清洗机(上海睿祺);2-16P离心机(SIGMA)。

1.3 试剂

乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯;十二水合磷酸氢二钠、十水合四硼酸钠、盐酸均为分析纯;水为超纯水。

氨基酸衍生化试剂:硼酸盐缓冲液、FMOC试剂、OPA试剂(4℃保存，使用前取约1mL于安培瓶中)。

1.4 实验方法

1.4.1 游离单糖及寡糖的测定

1.4.1.1 标准品溶液制备

果糖(Sigma，纯度99% ，产品号F0127)、葡萄糖(Sigma，纯度99.5%，产品号G2870)、蔗糖(Sigma，纯度99.5% 产品号84097)、麦芽糖(Sigma，纯度99% ，产品号M9171)配成0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 g/100 mL的混合标准溶液。

1.4.1.2 样品制备

将菊花样品粉碎后过24目，取5.000 g加入100.00 mL水室温下超声提取20 min，过滤后滤液以7800 rpm(离心力6461 g)离心12 min，然后用脱脂棉过滤得到提取液。用安捷伦C18-ODS-Box，500 mg小柱进行净化，具体方法为:取2.00 mL ACN活化后弃去，再取2.00 mL水平衡后弃去，上2.00 mL样液弃去，再上2.00 mL样液收集，用0.22 μm滤头过滤后即可进样。

1.4.1.3 HPLC条件

系统:安捷伦1200HPLC，示差折光率检测器，色谱柱:ZORBAX Carbonhydrate Analysis Column (4.6×250 mm，5 μm)，流动相:75%ACN+25% H2O，流速:1.4 mL/min，25 min，柱温:30℃，检测器温度:30℃，进样量:20 μL。

1.4.2 游离氨基酸的测定

1.4.2.1 标准品溶液制备

氨基酸标准溶液100 pMoles/μL(安捷伦部件号:5061-3332)，250 pMoles/μL(安捷伦部件号: 5061-3333)，1 nMoles/μL(安捷伦部件号:5061-3334)、氨基酸辅助试剂盒(安捷伦部件号:5062-2478)、γ-氨基丁酸(GABA)标准品。以氨基酸辅助试剂盒中正缬氨酸和肌氨酸为内标物，配成含内标500 pMoles/μL，最终浓度分别为 90、225、900 pMoles/μL的氨基酸混合标准液。

1.4.2.2 样品制备

将菊花样品粉碎后过24目，取5.000 g加入100.00 mL水在室温下超声提取20 min，过滤后滤液以7800 rpm(离心力6461 g)离心12 min，然后用脱脂棉过滤得到提取液，再用0.22 μm滤膜过滤。准确吸取50 μL10 nMoles/μL内标储备液、950 μL样品滤过液于2 mL样品瓶中，充分摇匀后待测。

1.4.2.3 色谱条件

液相色谱柱:Aglient ZORBAX快速分离高通量Eclipse Plus C18(3.0×50 mm，1.8 μm)，流动相A: 10 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L Na2B4O7，pH 8.2，流动相B∶乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10(体积比)，流动相流速:0.85 mL/min，泵参数:混合器和脉冲阻尼器用100 mm长的管线(0.12 mm内径)旁路连接，左柱温箱:40℃，右柱温箱:30℃，FLD检测器设置:峰宽＞0.01 min(0.2 s)，7.00 min停止采集。流动相梯度条件见表1。.

表1 流动相梯度条件Table 1 Gradient system of mobile phase

待流速和柱温稳定后，进行空白运行。准确吸取三组氨基酸混合标准系列工作液注射入HPLC，在相同的色谱条件下注射测试液。测试液以峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 游离糖含量测定结果

各菊花样品中游离糖类含量结果见表2，色谱图见图1。

菊花中游离糖主要为果糖和葡萄糖，其中果糖的含量为5.36～11.58 g/100 g，比葡萄糖高出1%～3%左右，蔗糖和麦芽糖并未检出。菊花中总游离糖含量为9.07～18.76 g/100 g，黄山贡菊中含量最高，为18.76 g/100 g，约是滁菊、黄菊、杭白菊的2倍;黄山贡菊的变种金贡菊中游离糖含量也较高，为18.51 g/100 g;金香菊即黄山地区所产药用菊花，其游离糖的含量也达到15.39 g/100 g;野菊花和河南的怀菊中游离糖含量相似，为13.91、13.46 g/100 g，七月菊、河北的祁菊及亳州的亳菊中游离糖含量相对较低，分别为11.62、11.28、10.09 g/100 g。

2.2 游离氨基酸含量测定结果

表2 不同品种菊花中游离糖类含量(g/100 g)Table 2 Contents of free sugars in different kinds of medicinal Flos chrysanthemi(g/100 g)

图1 游离糖HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of free sugars

表3 不同品种菊花中游离氨基酸的含量(g/100 g)Table 3 Contents of free amino acids in different kinds of medicinal Floschrysanthemi(g/100 g)

各菊花样品中游离氨基酸含量结果见表3，色谱图见图2。

氨基酸尤其是游离氨基酸不仅是菊花的重要呈味物质之一同时也是菊花的主要营养成分。由结果可以看出，各不同品种菊花中均含有19种氨基酸，其中包括7种必需氨基酸、9种药用氨基酸、5种增香氨基酸，分别占游离氨基酸总量的 8.14% ～22.12%、19.38%～39.33%、7.94%～20.15%。总游离氨基酸含量七月菊中最高，达2.806 g/100 g，是杭白菊的4.98倍;滁菊、祁菊、贡菊、金贡菊、野菊、怀菊中含量相当，分别为2.066、1.962、1.926、1.852、1.663、1.628 g/100 g;黄菊、金香菊、亳菊中含量分别为1.203、1.173、0.931 g/100 g。各种游离氨基酸中天门冬酰胺，谷氨酰胺，精氨酸以及脯氨酸在菊花中的含量比较高;脯氨酸和精氨酸是与菊花甘味有关的氨基酸，其含量分别为 0.1511～0.6089、0.028～0.27 5 g/100 g，天门冬酰胺和谷氨酰胺的含量分别为 0.0525～0.9114、0.0215～0.5371 g/100 g。

注:a-必需氨基酸;b-药用氨基酸;c-增香氨基酸;“-”未检出Note:a-Essential amino-acid;b-Amino acids for medical purposes;c-Amino acids for increasing fragrances;“-”Not be detected

图2 游离氨基酸HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of free amino acids

3 结论与讨论

3.1 目前关于菊花中游离糖的研究未见报道，本论文采用HPLC示差折光法检测不同品种菊花中游离糖的含量，其中黄山贡菊中含量最高，其余依次为金贡菊、金香菊、野菊、怀菊、七月菊、祁菊、亳菊、杭白菊、黄菊、滁菊。关于菊花中氨基酸类研究报道主要有王庆兰等采用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定了不同品种菊花中的水解氨基酸含量［7］;卢金清等也采用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定了金菊花中的游离氨基酸含量［8］。本论文采用了灵敏度更高的HPLC柱前衍生法测定了11个不同品种菊花中的氨基酸含量，其含量依次为七月菊＞滁菊＞祁菊＞贡菊＞金贡菊＞野菊＞黄菊＞金香菊＞亳菊＞杭白菊。

3.2 由于品种、产地、气候土壤条件及加工方式不同，造成不同品种的药用菊花中游离糖类和游离氨基酸类含量差异较大，黄山地区所产的黄山贡菊在游离糖类和游离氨基酸含量相对较高，这与黄山贡菊所特有的甘甜鲜醇滋味相一致，感官审评显示黄山贡菊在风味上优于其他品种菊花，黄山贡菊比较适合应用于菊花饮料和其它食品的开发，作为黄山市地道药材具有较广阔的开发和应用价值。

1 Nanjing University of Traditional Chinese Medicine(南京中医药大学)，Dictionary of Chinese Traditional Drugs.Shanghai Scientific and Technical Publishers(上海科学技术出版社)，2006:2898-2901.

2 Duan CX(段崇霞)，Zhang ZZ(张正竹).Comparison of the functional constituents in four kinds of medicinal Flos chrysanthemi.J Anhui Agric Univ(安徽农业大学学报)，2008，35:99-105.

3 Jia LY(贾凌云)，Sun QS(孙启时)，Huang SW(黄顺旺).Comparison of various constituents in eight ofChrysanthemum.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2004，35:1180-1181.

4 Eun-Kyung Jung，Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil ofChrysanthemum indiumagainst oral bacteria.J Bacteriol Viro，2009，39(2):61-69.

5 Zhang J，Ding AW.Two new flavonoid glycosides fromChrysanthemum morifolium.Chin Chem Lett，2006，17:1051-1053.

6 Peng SP(彭少平)，Gu ZL(顾振纶).Comparison of trace elements and amino acids between Jinju and several kinds of commercial Flos chrysanthemi.Fujian J Tradit Chin Med(福建中医药)，2005，36(4):41-43

7 Wang QL(王庆兰)，Lin HB(林慧彬)，Zhang SQ(张素芹).Comparison of amino acids in different kinds of Flos chrysanthemi.Chin J Tradit Med Sci Technol(中国中医药科技)，2005，12:249.

8 Lu JQ(卢金清)，Huang F(黄芳)，Jiang SJ(蒋胜军)，et al.The determination of trace element and amino acids inDendranthema morifolium.J Hubei Coll Tradit Chin Med(湖北中医学院学报)，2006，8:39-40.

Analysis of Free Sugars and Amino Acids in Different Kinds of Medicinal Flos Chrysanthemi

GAO Xue-ling1，2*，HE Man-man1，2，ZOU Min-liang3，YUE Peng-xiang1，ZHA Fang-fang1

1Anhui Agricultural University;2Anhui Provincial Lab of Food Safety Analysis and Detection，Hefei 230036，China;3Huangshan Tianjian Agricultural Sci-Tech Ltd，Huangshan 245700，China

The experiments were conducted with HPLC methods to determine the contents of free sugars and amino acids in various species of medicinal Flos chrysanthemi.The results showed that the main free sugars in Flos chrysanthemi were fructose and glucose;there were no sucrose and maltose.The total contents of free sugars in Flos chrysanthemi were in the range of 9.07～18.76 g/100 g.The highest content of total free sugars was found in Gongju with 18.76 g/100 g，while the lowest content in Huangju with 9.01 g/100 g.The total levels of free amino acids in Flos chrysanthemi ranged from 2.806 to 0.563 g/100 g，among which Qi yueju showed the highest level of total free amino acids with 2.806 g/100 g，Hang baiju showed the lowest level of total free amino acids with 0.563 g/100 g.

Flos chrysanthemi;free sugars;free amino acids;content determination

R284.2

A

1001-6880(2012)05-0639-05

2010-11-15 接受日期:2011-04-18

国家级星火计划项目(2010GA710027)

*通讯作者 E-mail:sharling@ahau.edu.cn