茚三酮薰显法在人体接触细胞发现采集中的应用

杨 电，刘 超，徐曲毅，张 翼

（广州市刑事科学技术研究所，广东 广州510030）

茚三酮薰显法在人体接触细胞发现采集中的应用

杨 电，刘 超，徐曲毅，张 翼

（广州市刑事科学技术研究所，广东 广州510030）

目的 研究茚三酮薰显法在人体接触细胞发现采集中的应用价值。方法 对衣服、口罩、棍棒等可疑人体接触细胞检材258份，采用1%茚三酮溶液进行显色反应，然后用磁珠法提取DNA，并进行DNA定量和STR检测。结果 可疑人体接触细胞检材中有172份显色反应阳性，其中115份检出的DNA浓度在0.02ng/μL以上并检出6个以上STR基因座的基因型，检出率为66.86%；显色反应阴性的86份检材均未检出DNA浓度或成功进行STR基因型。结论 茚三酮薰显技术可用于指导案件人体接触细胞的发现采集。

法医遗传学；人体接触细胞；茚三酮显现技术；STR分型

Abstract：ObjectiveTo evaluate the applicability of the ninhydrin-dyed method in the detection of human epithelial cells.Method 258 samples of clothes，masks and staves which might bear epithelial cells，were dyed with 1%ninhydrin，and DNA specimens were extracted by the magnetic beads method.Then DNA quantification and STR genotyping were performed to the collected samples.Results172 samples showed positive result，of which 115 had DNA concentrations above 0.02ng/μL and no less than 6 STR loci，with a detection rate of 66.86%.86 samples showed negative result，of which neither DNA nor STR loci could be detected.ConclusionNinhydrin-dyed method can be applied in the detection of human epithelial cells.

Key words：forensic genetics；epithelial cell；ninhydrin-dyed method；STR genotype

随着DNA检验在案件侦破中发挥的作用越来越强，近年来人体接触细胞检材的数量直线上升。人体接触细胞检材与常见生物检材如血痕、精斑相比，肉眼观察很难判断是否存在人体接触细胞及其在载体上的具体部位、数量的多少。因此迫切需要一种可指示人体接触细胞存在的简便有效方法以帮助法医工作者有效地对人体接触细胞进行提取、富集，提高DNA检验的成功率。2004年，M.M.Schulz等[1]人曾报道在1宗凶杀案中利用茚三酮显现潜在手印的方法作为发现人体接触细胞的预试验取得了良好效果。但目前国内只是对显现的指印进行DNA检验进行了较多的研究[2-3]，对手印显现方法用于寻找人体接触细胞的预试验方法的研究尚未见报道。本文采用1%茚三酮溶液薰显案件提取的可疑人体接触细胞检材，提取DNA同时进行DNA定量和STR分型。结果表明，茚三酮薰显技术在指示人体接触细胞存在方面具有简便快捷直观、不影响DNA检验的优越性，可用于指导案件人体接触细胞的发现采集。报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

衣服、裤子、口罩、帽子、棍棒、纸张、枕套、手套、电线、螺丝批、饮料瓶口、杯口、各种擦拭物等可疑人体接触细胞检材258份，均为2010年以来广州市刑事科学技术所实际案件检材。

1.2 实验方法

1.2.1 茚三酮熏显

配制1%茚三酮乙醇溶液于喷罐中。对纸张、手套、口罩等浅色渗透性载体采用茚三酮溶液均匀喷雾后置温度70℃的茚三酮熏显柜中处理10min[4]。对头套、深色手套等深色载体采用生物脱落细胞提取仪（公安部物证鉴定中心）吸取或脱落细胞粘取器（公安部物证鉴定中心）粘取，电线、螺丝批等非渗透性载体上可能存在人体接触细胞的部位采用脱落细胞粘取器粘取或棉签擦取；将吸附后的滤膜、粘附的胶带纸或擦拭物置离心管中滴加茚三酮溶液湿润后70℃保温5min。对棍棒等无法置熏显柜中熏显的大件物品用茚三酮溶液喷雾后置室温6h以上[5]。检材熏显时均同时设已知阳性和阴性对照。

1.2.2 DNA提取

对可疑接触检材中茚三酮显色阳性者提取阳性部位，阴性者按经验提取检材，然后按文献[5]在Maxwell（美国Promega公司）16自动仪上提取DNA，洗脱体积均为 30μL。

1.2.3 DNA定量

按Quantifiler法医人类DNA定量试剂盒（购自美国AB公司）使用手册在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行定量PCR反应。

1.2.4 STR复合扩增和检测分型

用SinofilerTM Kit（美国AB公司）进行复合扩增，扩增体系为10μL，模板量为4μL。在3130xL遗传分析仪（美国AB公司）上进行毛细管电泳检测分型。

《法庭科学DNA数据库建设规范》中规定，D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16 S539、D18S51、D21S11、CSF1PO、TPOX、TH01、VWA、FGA 等 13个核心基因座和Amelogenin基因座中须有任意6个以上的基因座检测成功，方能将DNA分型数据及信息代码输入省级DNA数据库和市级DNA数据库。借鉴此标准，本研究将检出6个以上数量的基因座（RFU≥50）认为检出，反之则为未检出。

2 结果

2.1 茚三酮熏显反应

图1为部分可疑人体接触细胞检材茚三酮熏显后的照片。258份可疑人体接触细胞检材，有172份显呈蓝紫色阳性反应，其中一件确定放置6个月以上的穿过的衣服和一把放置3个月以上的用过的牙刷也显示出阳性反应。另外86份可疑人体接触细胞检材未呈现颜色反应。

2.2 DNA定量及STR检验结果

172份茚三酮反应阳性的样品中有115份检出的DNA浓度在0.020ng/μL以上并检出6个以上基因座的基因型，检出率为66.86%；另57份样品检出DNA浓度在0.02ng/μL以下，且在空白对照正确的情形下，检出的基因座数均小于2个，因此视为未检出。茚三酮反应阴性的86份样品无一例测出DNA浓度，STR分型结果也与空白对照一致（见表1）。

表1 258份检材经茚三酮熏显后提取DNA的STR检验结果

图1 部分可疑人体接触细胞检材茚三酮熏显后的照片

2.3 案例应用

2011年某月某日，广州市公安局禁毒支队破获一宗制贩毒案，在某农场内捣毁一个制毒工厂，缴获制毒工具一批。为确定进出制毒工厂的嫌疑人，提取了工厂内发现的7根吸管、6个一次性塑料杯、5枚烟头和6把牙刷要求进行DNA检验。对上述检材采用茚三酮进行显色反应，7根吸管、3个一次性塑料杯、2枚烟头和2把牙刷呈现兰紫色阳性反应，3个一次性塑料杯、3枚烟头和4把牙刷显色反应阴性。对所有检材采用磁珠法提取DNA后进行DNA定量和STR反应，显色反应阳性的5根吸管、2个塑料杯、2枚烟头和2把牙刷检出的DNA浓度≥0.10ng/μL，并成功检出共6名男性个体的15个STR基因座基因型，显色反应阳性的2根吸管、1个塑料杯未检出DNA浓度和STR基因型。显色反应阴性的3个塑料杯、3枚烟头和4把牙刷均未检出DNA浓度和STR基因型。

3 讨论

人体接触细胞的DNA检验是法医DNA检验的热点和难点之一。随着DNA检验灵敏度的提高，特别是近年来MiniSTR、单细胞DNA检验和1μl体系扩增等新技术的出现，使DNA含量少于100pg的LCN样品也能够有效分型，甚至只含有单个细胞的微量生物检材也有成功分型的报道。但是，目前对人体接触细胞检材的检验成功率并不高，许多检材如刀柄、棍棒、绳索、指印上的人体接触细胞检验成功率不到30%。这主要原因在于肉眼观察难以判断人体接触细胞的有无及在载体上的具体部位、数量的多少。显微镜检查是确证人体接触细胞存在的金标准，但不能对载体上的人体接触细胞直接检查，将载体上的人体接触细胞转移下来涂片检查操作繁琐，操作过程中可能造成污染和细胞损失，因此实际检案中很少采用显微镜对人体接触细胞进行检查。国外有研究采用荧光光谱和拉曼光谱分析技术对精液、汗液、唾液、尿液等体液斑进行无损性的预试验检测，但设备要求高，且只是处于研究阶段[6]。而随着证据意识的增强，办案部门为了不放过任何一个可能留下嫌疑人信息的证据，对嫌疑人可能触碰过的地方、物品凡是显现不了指纹或指纹显现不清的通通提取送检DNA。1宗凶杀案往往提取几十份甚至上百份检材，其中大约一半为怀疑人体接触细胞检材。DNA检验工作者为了证实送检的物品上是否存在人体接触细胞，往往要反复多次地进行DNA提取、STR扩增和检测的操作，浪费大量的人力、物力和时间。因此迫切需要一种可提示人体接触细胞的存在及数量的多少的简便有效方法以帮助法医工作者提高接触DNA检验的效率。

在手印显现方法中，有些是利用化学试剂与指印中的氨基酸或蛋白质进行显色反应或荧光反应[4]。现有研究均显示这些手印显现方法不影响DNA检验[1-3]。人体接触细胞的形成原理与手印形成的原理一样都是基于接触-交换理论，由人体的皮肤粘膜与客体接触后形成，人体接触细胞中肯定含有氨基酸，因此采用针对氨基酸反应的潜在手印显现方法作为指示人体接触细胞存在的预试验方法完全可行。

利用茚三酮与指印中的氨基酸或蛋白质进行蓝紫色反应，是浅色渗透性载体上潜在指印显现的经典方法。茚三酮薰显方法操作简单快速、显色反应灵敏，不需要任何特殊设备，只需要普通的加热装置，甚至在室温下也能完成薰显，而且颜色鲜艳不褪色。本研究采用茚三酮薰显方法对案件提取的258份可疑皮肤脱落细胞或口腔脱落细胞检材进行薰显反应，检材上与人体接触过的部位均呈蓝紫色反应。在同一载体上，颜色反应的深浅程度与人体接触程度正相关，与人体接触的时间越长、接触得越紧密，颜色反应越明显。未与人体接触的部位无颜色反应。172份阳性反应的样品中有115份检出6个以上基因座的基因型，检出率为66.86%，而显色反应阴性的86份检材均未检出STR基因型。可见，茚三酮薰显方法可用于指导人体接触细胞检材的发现采集。

在利用茚三酮对人体接触细胞检材进行薰显的过程中，本研究发现对于非渗透性载体、深色载体上可疑人体接触细胞检材，茚三酮难以直接薰显，只能将其转移到滤膜、胶带纸或棉签上再进行显色反应，不能直接反映人体接触细胞在这类载体上的原始分布情况。如何借鉴潜在指纹的其它显现方法以指导非渗透性载体、深色载体上人体接触细胞检材的发现和采集，有待下一步研究。

[1]M.M.Schulz，H.-D.Wehner，W.Reichert，et al.Ninhydrindyed latent fingerprints as a DNA source in a murder case[J].Journal of Clinical Forensic Medicine，2004，（11）：202-204.

[2]王德明，顾丽华，阎建军，等.3种提取胶带粘面汗潜指印中DNA 的方法比较[J].中国法医学杂志，2005，20（2）：65-67.

[3]赖跃，王传海，秦洁，等.8种方法显现的汗潜指印STR分型研究[J].中国法医学杂志，2007，22（6）：366-368.

[4]赵向欣.指纹技术[M].北京：中国公安大学出版社，2002：277-304.

[5]杨电，刘超，徐曲毅，等.DNA IQ磁珠法结合Maxwell 16自动仪提取接触 DNA进行 STR 检验[J].刑事技术，2011，（3）：3-5.

[6]Virkler Lednev I K.Analysis of body fluids for forensic purposes：from laboratory testing to non-destructive rapid confirmatory identification at a crime scene[J].Forensic Sci Int，2009，188（1/3）：1-17.

（本文编辑：李成涛）

Application of the Ninhydrin-dyed Method in the Detection of Human Epithelial Cells

YANG Dian，LIU Chao，XU Qu-yi，ZHANG Yi
（Guangzhou Criminal Science&Technology Institute，Guangzhou 510030，China）

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2012.05.016

1671-2072-（2012）05-0105-03

2012-02-17

公安部应用创新计划资助项目（2005YYCX57136）；广东省法医遗传学重点实验室建设项目（2010A060801001）

杨电（1969—），女，主任法医师，硕士，主要从事法医DNA检验与研究工作。E-mail：yangdianyy@163.com。