术前热疗联合灌注化疗对肺癌细胞凋亡及相关基因的影响

祝淮阳 熊瑜

肺癌是一种严重危害人类健康的恶性疾病，其发病率和死亡率在世界范围内居所有恶性肿瘤之首。其发生、发展和转归与细胞凋亡有密切关系，其实质是细胞增殖与凋亡的失衡，即增殖过度或凋亡不足。诱导癌细胞的凋亡，抑制其增殖已成为肺癌辅助治疗的新策略。本研究对37例中晚期肺癌患者采用术前热疗联合灌注化疗，观察凋亡调控基因p53表达、癌细胞凋亡的情况，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 83例患者均来自2006年7月至2009年6月在我科治疗的患者。诊断及入组标准:术前有胸部X线片及CT等的临床诊断，经纤维支气管镜检查并活检(包括刷片)所得的病理诊断。术后均有切除标本的最后病理学诊断。术后的TNM分期采用2009年国际抗癌联盟(UICC)的TNM分期修订标准。中晚期非小细胞肺癌的确定标准为ⅢA期和ⅢB期肺癌，以及ⅡB期肺癌手术时发现肺门淋巴结融合固定而不能彻底清扫，又无条件行全肺切除，达不到根治性手术要求者。分为3组:术前热疗联合灌注化疗组(A组)37例，年龄45～70岁，行根治性肺癌切除31例，未达到根治手术标准共6例。术前灌注化疗组(B组)31例，年龄45～70岁，术前行灌注化疗，行根治性肺癌切除26例，未达到根治手术标准共5例。直接手术组(C组)15例，年龄45～65岁，仅行根治性肺癌切除14例，未达到根治手术标准共1例。3组之间患者年龄、性别、分期、分型等无统计学差异(P＞0.05)，具有可比性。见表1。

表1 3组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 介入灌注化疗操作:A、B组术前1周均先经股动脉穿刺插管至支气管动脉、锁骨下动脉或肋间动脉造影，根据造影结果将导管超选择性插入肿瘤供血动脉，注入化疗药物顺铂和丝裂霉素。根据患者一般情况及体表面积决定用药量，一般顺铂80～100 mg，丝裂霉素14～20 mg。

1.2.2 热疗:使用珠海市和佳医疗设备有限公司HG-2000体外高频热疗机，频率为13.56 MHz，上下电极直径均为17 cm，电压200 V，功率3000 W，治疗时间60 min/次，测温系统由测温传感器和计算机组成，深度可达17～25 cm，温度控制在41～44℃，机控输出功率90% ～95%(计算机控制并与温度相关，如大于此数值则温度达44℃，如小于此数值则温度＜41℃)。术前热疗联合灌注化疗组行介入灌注化疗前1 h，用HG-2000体外高频热疗机治疗1次，温度控制在41～44℃，注药24 h后再次热疗1次，治疗时间60 min/次。

1.2.3 主要试剂:即用型鼠抗人 p53、bcl-2、PCNA单克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒，购自福州迈新生物技术开发公司。该试剂盒包括:即用型过氧化酶阻断剂(试剂A)，即用型阻断血清，10%非免疫动物血清(试剂B)，即用型生物素标记的第二抗体(试剂C)，即用型链霉菌素蛋白-过氧化酶溶液(试剂D)。

1.2.4 标本的收集和制片方法:A、B组所有病例于治疗前经细针穿刺取材，手术中留取肿瘤组织标本。所取标本常规甲醛溶液固定，后脱水、透明、浸蜡、包埋。石蜡包埋，将每一癌组织蜡块切片4张，厚为4 μm，1张常规HE染色，另3张采用链霉菌抗生物素过氧化物酶(streptavidin peroxidase conjugated methods，S-P)免疫组化法分别检测癌组织中PCNA、bcl-2、p53蛋白的表达情况。

1.2.5 凋亡指数(AI)的计算:高倍镜下(×400倍)分别观察治疗前后癌组织HE染色片10个视野，根据凋亡细胞的形态学特征识别凋亡细胞，其特征如下:(1)单个萎缩细胞，周围有空晕;(2)核固缩;(3)浓缩的嗜酸性细胞质;(4)凋亡小体形成［1］。AI=(凋亡细胞数/癌细胞总数)×100%。

1.2.6 增殖指数(PI)的计算和bcl-2、p53染色结果的判断:PCNA和p53为细胞核内着色，bcl-2为核膜和细胞质着色，光镜下呈现黄到棕褐色为阳性。选取10个高倍视野(×400)，计算PCNA阳性细胞数所占比例作为PI，即PI=PCNA阳性细胞数/癌细胞总数×100%，用均数±标准差表示。bcl-2和p53染色结果规定:阳性细胞数≤10%，或背景同空白对照时为(-);10%＜阳性细胞数≤25%为(+);25% ＜阳性细胞数≤50%为(++);阳性细胞数＞50%为(+++)。

1.3 统计学分析 数据用SPSS 10.0统计软件包作统计分析，计量资料采用配对t检验和方差分析，等级资料采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A、B、C组手术前后癌细胞的AI、PI间的比较 3组治疗前癌细胞的AI、PI差异无显著性意义。A、B组病例治疗后AI高于治疗前，治疗后PI低于治疗前，差异有统计学意义(P＜0.01);A组与B组的AI均高于C组，A组的AI又高于B组，差异均有统计学意义(P均＜0.01);A组与B组的PI均低于C组，A组的PI又低于B组，差异均有统计学意义(P均＜0.01)。见表2。

表2 3组手术前后癌细胞的AI、PI间的比较(±s)

表2 3组手术前后癌细胞的AI、PI间的比较(±s)

注:与治疗前比较，＊＊P＜0.01;与 C组比较，△△P＜0.01;与 B组比较，##P＜0.01

2.2 3组手术前后bcl-2、p53表达的变化 A组、B组病例治疗前癌组织bcl-2、p53阳性表达差异无统计学意义(P＞0.05)，手术后癌组织bcl-2、p53阳性表达低于治疗前，差异有统计学意义(P＜0.01);A组术后癌组织bcl-2、p53阳性表达低于B组，差异有统计学意义(P＜0.01);A组、B组病例治疗前癌组织bcl-2、p53阳性表达较C组高，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表3。

表3 3组手术前后bcl-2、p53表达的变化(n)

3 讨论

热疗是临床肿瘤治疗的一种重要手段，通过加热肿瘤使其局部温度升高达到41℃左右。肿瘤组织含水率高，组织内血液循环不良，因而散热性差，其温度升高比周围正常组织更明显，一般高出5℃左右，加之肿瘤细胞耐热性差，当温度升高至41℃时即可被杀死，而健康组织却可耐受45℃的高温，因此可以利用微波加热来治疗肿瘤［1］。热疗可以加强和协同化疗药物发挥作用，热疗与化疗联合应用具有明显的增效互补和减少并发症的作用［2］。

细胞凋亡是一种由内源性多基因控制的、主动的程序化细胞死亡过程，这种死亡方式可以与具有自我更新能力的组织通过有丝分裂不断产生新细胞相平衡，因而对正常组织维持稳定具有重要作用。肿瘤的发生、进展取决于凋亡、增殖两方面的因素，细胞凋亡受抑是肿瘤形成的原因之一。近年来大量研究表明，热诱导细胞凋亡是热疗杀伤肿瘤细胞的主要机制［3］，在敏感组织中，加热至42℃，30 min可以引起广泛的细胞凋亡，而加热到46℃或更高则产生坏死，且不同肿瘤对高温反应差别很大［4］。

抗癌药物具有诱导癌细胞凋亡，抑制其增殖的作用，动脉灌注化疗已成为晚期肺癌的综合治疗措施。热疗技术作为恶性肿瘤新的治疗手段，安全性高，无明显的不良反应［5］，能够在有效的温度范围内提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药［6］，诱导肿瘤细胞发生凋亡［7］。同时热疗可致细胞内环境酸化，促进化疗药物诱发肿瘤细胞凋亡，与动脉灌注化疗有明显的协同作用。

研究表明，热疗和化疗联合对 A549细胞生长的抑制作用强于单纯热疗和单纯化疗［8］，多集中在体外试验，而较少临床研究。本研究采取术前行热疗联合灌注化疗，取术前及术后病理组织进行研究，结果表明，术前热疗联合灌注化疗和术前灌注化疗组术后癌组织的AI明显升高，提示治疗肺癌的临床疗效部分是通过促进肿瘤细胞的凋亡实现的，术前热疗组的AI明显高于灌注组，提示热疗参与肿瘤细胞的凋亡，且与化疗实现了协同作用。

随着现代肿瘤热疗技术的发展，许多实验研究已经证实热疗是一种非常理想的辅助治疗手段，热疗可以直接诱导肿瘤细胞凋亡，并通过诱导p53的表达、下调凋亡抑制基因bcl-2的表达以利于细胞进入凋亡。

本研究采用术前热疗联合灌注化疗，充分发挥热疗与化疗抗肿瘤的协同作用，旨在探讨术前热疗联合灌注化疗对中晚期肺癌患者癌细胞凋亡和增殖的影响。由于AI、PI是评价肿瘤细胞凋亡程度和增殖活性的最常用的指标，治疗后癌细胞AI、PI的变化亦可作为判断治疗敏感性和疗效的标准［9］，因此我们研究提示:术前热疗联合灌注化疗能使肺癌癌细胞凋亡增加，增殖下降，是较理想的综合治疗方法之一。

bcl-2作为凋亡抑制基因，其蛋白产物可保护多种细胞免于各种诱因所致的细胞凋亡。p53是一种抑癌基因，在肺癌中突变频率较高。正常的p53基因为野生型，发生突变者则称为突变型。野生型p53抑制细胞增殖，促进细胞凋亡;而突变型p53功能与之相反，并可抑制野生型p53的抑癌活性，p53遂由抑癌基因转为原癌基因。我们研究发现，A、B组治疗前癌组织bcl-2、p53阳性表达较C组高，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明bcl-2、p53阳性表达水平与肺癌的分期有关，和先前的研究一致。A、B组病例治疗前癌组织bcl-2、p53阳性表达差异无统计学意义。A组、B组术后癌组织bcl-2、p53阳性表达低于治疗前，差异有统计学意义(P＜0.01)。说明术前热疗联合灌注化疗能发挥抗肿瘤的协同作用，明显下调bcl-2和p53的阳性表达，从而使AI升高、PI下降。

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