金属蛋白酶-9和肿瘤坏死因子在子宫内膜异位症的表达

张红娟，何康玲，王 莉

金属蛋白酶-9和肿瘤坏死因子在子宫内膜异位症的表达

张红娟，何康玲，王 莉

子宫内膜异位症（EM）；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）；肿瘤坏死因子（TNF）

具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆黏膜以外的身体其他部位时称为子宫内膜异位症（endometriosis，EM）。EM是一种具有恶性侵袭行为的良性妇科疾病，主要的临床表现为痛经、盆腔包块和不孕等，近年发病率不断上升，严重影响妇女的生殖健康及生活质量。其发生机制至今尚不清楚，故引起研究者的广泛关注，并成为当今一个研究热点。已有大量研究报道，免疫系统的变化，包括各种免疫球蛋白、细胞因子（CK）、整合素家族等均参与了EM的发病过程，并起着关键作用。肿瘤坏死因子（TNF）能够促进血管内皮生成因子 （VEGF）的生成，基质金属蛋白酶9（MMP-3）能降解细胞外基质ECM（extra cellular matrix，ECM）。本研究通过测定EM患者血清中的MMP-9、TNF及异位和在位内膜中MMP-9的表达，探讨TNF与MMP-9在EM发病机制中的相关性，为治疗EM提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2009-01～2011-10因EM在笔者所在医院妇产科行腹腔镜手术的患者32例作为试验组，年龄21～45岁，平均37.18岁；均取在位内膜和异位内膜灶，分为在位内膜组与异位内膜组。选取同期因子宫肌瘤切除子宫或单纯肌瘤剔除患者的子宫内膜32例作为对照组，年龄27～49岁，平均40.31岁。所取标本经中性甲醛液固定后石蜡包埋，待用。同时抽取试验组和对照组患者术前清晨空腹静脉血5 ml，自然凝固，台式离心仪2500 r/min，5 min分离血清，贮存于-80℃冰箱中，待测。研究对象术前3个月内均未用激素治疗，术后组织病理学检查证实为EM和子宫平滑肌瘤。

1.2 方法 取异位内膜组在位子宫内膜和异位内膜标本，以及对照组的子宫内膜，放入多聚甲醛（10%PF）固定液于4℃冰箱中固定24～48 h。组织经过冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片后烤干备用（光镜和免疫组织化学）。每个标本取1张切片用HE染色，进行组织结构的观察。所有标本经10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，4 μm连续切片备用，采用免疫组化SABC法检测筛选标本中MMP-9，一抗及SABC试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，一抗为鼠抗人MMP-9单克隆抗体，主要操作步骤如下：用3%H2O2封闭内源性过氧化酶20 min；于98℃下微波修复抗原，4℃孵育过夜后，加正常羊血清封闭20 min；滴加一抗MMP-9抗体稀释后的质量浓度分别为1∶100和1∶100滴加二抗；室温放置10 min，滴加试剂SABC；10 min后DAB染色5 min；苏木素复染。血清中MMP-9、TN含量的测定采用ELISA法，严格按试剂盒说明的实验步骤检测。

1.3 结果判定 光学显微镜下观察组织切片细胞胞浆、基质的显色反应，MMP-9阳性信号均呈棕黄色或棕褐色。利用全自动病理图像分析仪及图像分析软件对切片进行分析，每张切片随机选取5个视野，以平均光密度 （mean optical density，MOD，MOD=有效测量面积范围内目标染色区累积光密度值/有效测量区域面积）表示MMP-9表达强度，每次阅片前校正光密度，阅片时保持每张切片光线、白平衡等参数不变。

2 结 果

2.1 两组患者血清中MMP-9、TNF含量 试验组患者血清中MMP-9、TNF含量明显高于对照组（P<0.01），见表1。

表1 试验组和对照组患者血清中MMP-3、TNF的含量

表1 试验组和对照组患者血清中MMP-3、TNF的含量

与对照组比较，*P<0.01

MMP-3（ng/ml） TNF（pg/ml）34.472±5.447*19.629±5.493*2.977±1.201 12.527±3.529分组 n试验组 32对照组 32

2.2 MMP-9在不同内膜组织中的表达 在各组子宫内膜组织中，MMP-9阳性信号主要位于组织的腺体上皮细胞，部分位于间质中。MMP-9在异位和在位内膜组中的表达均无显著性差异（P＞0.05），但均高于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 MMP-9在各组子宫内膜中的表达（MOD，

表2 MMP-9在各组子宫内膜中的表达（MOD，

与在位内膜组比较，*P＞0.05，与异位和在位内膜组比较，#P＜0.05

MMP-9 0.32±0.09 0.34±0.09*0.26±0.04#分组 n试验组在位内膜组 32异位内膜组 32对照组 32

3 讨 论

基质金属蛋白酶（MMPs）是锌依赖性的蛋白酶家族，是恶性肿瘤发生转移与浸润的一种重要介质。目前已证明EM患者子宫的在位和异位内膜均可分泌MMPs，并在EM的发病过程中具有重要作用。MMPs可以降解ECM和基底膜的所有成分，依其降解底物的不同可分为6型约19种。MMP-9是MMPs家族中相对分子质量最大的明胶酶，能降解ECMⅣ、Ⅴ型胶原和明胶等主要成分，并能促进血管内皮细胞生长，导致新生血管的形成，同时可通过与整合素的相互活化而加强细胞间的粘附作用，从而在子宫内膜细胞的异位粘附、种植、生长的过程发挥重要作用[1]。本文结果显示，MMP-9在异位和在位内膜组织中的表达显著高于对照组，说明异位和在位内膜组织中MMP-9的过度表达可能使异位和在位内膜具有很强的侵袭种植能力。

TNF是一类具有多种生物活性的细胞因子，是由激活的单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等产生的高效能的细胞因子，一方面是机体免疫保护的重要介质，另一方面可参与机体的免疫病理损伤[1]。本文结果表明，EM患者血清中的TNF的含量明显高于正常对照组，可能系腹腔液内存在大量的TNF入血所致，也可能与EM患者外周血单核细胞活性增强，免疫防御功能受到破坏，导致机体的细胞因子调节系统紊乱，过量的TNF不仅可以抑制IgG和IgM的产生，而且还影响某些克隆T细胞的分化，使T淋巴细胞不能发挥正常的免疫反应所致[2]。TNF-α通过介导炎症和免疫反应，使多种细胞产生多种细胞因子，促进子宫内膜间质细胞生长和分泌VEGF（血管内皮生成因子）。TNF可能诱导腹腔间皮细胞表达黏附分子，使内膜基质细胞粘附在腹腔间皮细胞，同时TNF通过促进子宫内膜间质细胞生长和分泌VEGF，使异位内膜基底部毛细血管的数量和面积增多，有利于内膜的种植、生长，向组织深部浸润。

研究认为TNF、血管内皮生长因子等细胞因子又可促进MMP的合成，从而在细胞粘附、种植、新生血管的形成、组织纤维化和机体免疫机制中起到非常重要的作用[3-7]。正是由于多种细胞因子与肥大细胞的相互作用、相互影响形成网络结构，共同促进了EM的形成和发展。本文结果也显示，EM患者血清中的MMP-9和TNF同时升高，一方面TNF通过自身炎性细胞因子的作用加速EM的发生发展，诱导腹腔间皮细胞表达粘附分子，使内膜基质细胞粘附在腹腔间皮细胞，促进内膜间质细胞的生长和VEGF的分泌；另一方面，通过诱导MMP-9的分泌，增强异位内膜对ECM水解破坏和促进异位灶新生血管的形成，协同促进了EM的发生发展。

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[2012-02-27收稿，2012-03-20修回]

[本文编辑：宋 敏]

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450007河南郑州，153医院妇产科（张红娟，何康玲，王莉）