响应面法优化唐古特白刺种子总黄酮超声提取工艺

胡 娜，杨仁明，何彦峰，王洪伦，王小艳，索有瑞*

1中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810001;2中国科学院研究生院，北京 100049

白刺(Nitraria)是蒺藜科(ZygophyUceae)的旱生或超旱生典型荒漠植物［1］，是西部蒙、藏、维等少数民族的传统药材，其果实具有较高的药用价值，可治疗胃病，有助于消化，还可治伤风感冒、头痛头晕［2］，具有降血糖、降血脂、抗氧化等作用［3］。研究表明，其药理活性与其果实中丰富的黄酮类、花色苷、总糖、维生素E及必需氨基酸等活性成分有关［5-7］。其中白刺总黄酮具有降低血清、肝组织中的MDA，增强其SOD、GSH-PX的活力，延缓衰老的作用［8］。

目前白刺种子中黄酮类化合物的提取方法主要有加热回流提取和索式提取，具有提取时间长、有机溶剂消耗量大、提取效率低等缺点。超声波提取是利用超声波在液体中产生“空穴作用”，破坏植物细胞和细胞膜结构，从而增强细胞内容物通过细胞膜的穿透能力，有利于黄酮类化合物的释放与溶出［9］。

本研究在单因素试验的基础上选择乙醇浓度、超声时间、超声温度3个主要因素，以总黄酮提取得率为响应值，采用响应面法对唐古特白刺种子中总黄酮超声辅助提取工艺进行了优化。以期为研究唐古特白刺种子总黄酮的超声提取路线提供参考，为唐古特白刺的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜白刺果实采摘于柴达木盆地，由中国科学院西北高原生物研究所卢雪峰博士鉴定为唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)的果实;芦丁，购自成都曼斯特生物科技有限公司(批号:MUST-11040302);石油醚、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DFY1000C高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司;UV-759型紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;KQ-250DB型超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司;101-1ES型电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂;优普UPT系列超纯水器，成都超纯科技有限公司;ALC-110.4型电子天平，德国Acculab公司。

1.3 方法

1.3.1 样品溶液的制备

将榨完果汁剩下的果渣进行清洗，去除果皮，保留种子，并将洗干净的白刺种子于60℃烘箱中烘至恒重。取200 g干燥好的白刺种子，用高速万能粉碎机粉碎，过32目筛，备用。

白刺种子除油脂:取100 g过筛后的白刺种子粉末，用石油醚索氏提取3次，每次2 h，待石油醚挥发完全后置于电热鼓风干燥箱中45℃条件下烘干，备用。

精确称取除脂后的白刺种子2.0 g置于100 mL圆底烧瓶中，按照一定的液料比、乙醇浓度、超声时间和超声温度进行超声提取，提取完成后过滤并用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，即为样品溶液。

1.3.2 标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品5.0 mg，加入60%的乙醇溶液，定容至50 mL的容量瓶中，摇匀，配制成0.1 mg/mL 的标准品溶液，分别取溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，加30%乙醇至5 mL，再加入0.3 mL 5%的 NaNO2溶液，摇匀放置6 min后再加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3溶液，摇匀放置6 min，最后加入4 mL 4%NaOH溶液，加水至刻度，摇匀放置15 min，在510 nm处测定其吸光值，以芦丁浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度值A为纵坐标作回归曲线，得回归方程为 A=12.792C-0.0035(R2=0.9990)。

1.3.3 总黄酮提取得率的计算

将测得的吸光度值代入回归方程计算总黄酮含量，即可求出样品溶液中总黄酮含量C，再代入下式计算白刺种子总黄酮提取得率。

式中:V为定容体积(mL)，M为称取的白刺种子的质量(g)，C为样品溶液中总黄酮的含量(mg/mL).

1.4 提取条件的优化设计

根据前期试验筛选，本试验主要研究乙醇浓度、超声时间、超声温度三个因素对响应值的影响，首先进行单因素试验。单因素试验只考察多个因素单独对响应值的影响，不能反映出多个因素之间相互作用的影响。通过单因素预试验，应用 Design-Expert8.0软件，设计3因素3水平的响应面试验，利用响应面试验结果，确定唐古特白刺种子总黄酮超声提取的最佳提取条件。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Levels and code of response surface experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对总黄酮提取得率的影响

图1 不同液料比对白刺种子总黄酮提取得率的影响Fig.1 Effects of ratio of material to water on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它条件不变(乙醇浓度75%，时间60 min，温度40 ℃)考察液料比(5、10、15、20、25 mL/g)对白刺种子总黄酮提取得率的影响。结果如图1所示，在5～15 mL/g液料比范围内，总黄酮提取得率随液料比的增加而呈上升趋势，这是因为溶剂用量越大对成分的溶解能力越强，黄酮类化合物在大剂量的溶剂中始终成“稀溶液”状态，利于扩散的进行。在液料比为15 mL/g时，总黄酮提取得率达到最大，说明一定比例的溶剂已将有效成分基本溶出完全。因此，从成本和能耗方面考虑，液料比选择在15 mL/g为宜。

2.1.2 乙醇浓度对总黄酮提取得率的影响

图2 乙醇浓度对白刺种子总黄酮提取得率的影响Fig.2 Effects of ethanol concentration on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它条件不变(液料比15 mL/g，温度40℃，时间60 min)，考察乙醇浓度(45%、55%、65%、75%、85%)对白刺总黄酮提取得率的影响。结果如图2所示，在乙醇浓度为45% ～65%的范围内，总黄酮提取得率随着乙醇浓度的增加而增加。但当乙醇浓度大于65%时，总黄酮提取得率随着乙醇浓度的增加而减小。因而，结合得率和成本考虑，应选择浓度为65%的乙醇提取白刺种子总黄酮。

2.1.3 超声时间对总黄酮提取得率的影响

图3 不同超声时间对白刺种子总黄酮提取得率的影响Fig.3 Effects of extraction time on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它条件不变(液料比15 mL/g，乙醇浓度75%，温度 60 ℃)，考察超声时间(20、40、60、80、100 min)对白刺种子总黄酮提取得率的影响。结果如图3所示，总黄酮提取得率随时间的增长呈上升趋势，60 min附近达到最大，之后趋于平缓，说明提取液内有效成分浓度已达到平衡。为减少能耗，节约时间，超声时间选择60 min左右为宜。

2.1.4 超声温度对总黄酮提取得率的影响

图4 不同超声温度对白刺种子总黄酮提取得率的影响Fig.4 Effects of extraction temperature on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它条件不变(液料比15 mL/g，乙醇浓度75%，时间60 min)，考察超声温度 20、30、40、50、60℃对白刺种子总黄酮提取得率的影响。结果如图4所示，在40℃之前，随着温度的升高，总黄酮提取得率逐渐增加，且增幅明显，40℃时达到最大，之后略显下降。这一趋势可能是由于温度过高，总黄酮类物质分解，使其得率下降，且在工业生产中，过高的超声温度耗能较大而不易操作，因此选择温度为40℃左右为宜。

2.2 响应面法优化白刺种子总黄酮工艺

2.2.1 响应面分析方案与结果

通过上述的单因素分析，我们筛选出了乙醇浓度、超声时间、超声温度三个主要因素，采用Box-Behnken设计结合响应面法，以总黄酮提取得率为响应值，对影响超声提取白刺种子总黄酮的工艺进行优化，试验结果见表2。

表2 试验设计与结果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

采用Design-Expert8.0软件对各因素进行回归拟合，得回归方程:总黄酮提取得率 =1.17+0.03X1+0.065X2+0.048X3+0.02X1X2+0.01X1X3+0.025X2X3-0.16-0.079-0.13

表3 方差分析结果Table 3 ANOVA of regression analysis

表3中的回归模型方差分析的结果表明:X1、X2、X3、X1X1、X2X2、X3X3(P ＜ 0.01)为极显著项;X1X2、X2X3(P ＜0.05)为显著项;X1X3项不显著。R2=0.9936表明该二次回归得到的白刺种子总黄酮提取得率模型与实际拟合较好，符合度为99.36%，说明使用该方程模拟实际的三因素三水平分析是可行的。同时，由 F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个因素对总黄酮提取得率影响的顺序为超声时间(X2)＞超声温度(X3)＞乙醇浓度(X1)。

图7 Y=f(X2，X3)的响应面与等高线Fig.7 Responsive surfaces and contours of Y=f(X2，X3)

2.2.2 因素间的交互影响

根据拟合模型绘制总黄酮提取得率响应面的三维图与等高线，可直观地看出响应面的最高点，即参数范围内的极值以及因素间的相互作用对响应值的影响，依次可以确定最佳工艺参数范围。Design-Expert8.0软件处理后三维响应面和等高线图见图5～7。

分析3组图可知，超声时间、超声温度对总黄酮提取得率的影响较为显著，表现为曲线较陡，即随着超声时间、超声温度的增加或减少，响应值变化较大;乙醇浓度对总黄酮提取得率的影响不大，表现为曲线较为平滑，即随乙醇浓度增加或减少，响应值变化较小。图5和图7的等高线图呈明显的椭圆形，说明超声时间和乙醇浓度的交互作用以及超声时间和超声温度的交互作用显著。图6的等高线图不呈椭圆形，说明乙醇浓度和超声温度的交互作用不显著。

2.2.3 白刺种子总黄酮提取工艺条件的确定

通过软件Design-Expert 8.0求解方程，得出了最优提取工艺条件为:乙醇浓度为65.7%，超声时间为67.6 min，超声温度为41.7℃，在此工艺条件下白刺种子总黄酮得率可达1.21%。

2.2.4 工艺验证

综合考虑时间、成本等因素，对工艺参数进行了一定的修正，确定适宜的提取工艺条件为:乙醇浓度为66%，超声时间为68 min，超声温度为42℃。在此条件下，进行了3次重复试验，白刺种子平均总黄酮提取得率为1.20%，与预测值基本吻合。

3 结论

通过Box-Behnken中心组合试验设计得到超声提取白刺种子总黄酮的优化工艺条件:乙醇浓度为66%，超声时间为68 min，超声温度为42℃，总黄酮提取得率为1.20%。结果表明，采用响应面法优化白刺种子总黄酮的提取工艺条件具有实际应用价值，为唐古特白刺的进一步开发利用提供了理论依据。

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