真菌竹黄双向调节TNF-α诱导的L929细胞凋亡过程

张树冰，周亚玲，李 凌，李 杰

中南大学生物科学与技术学院，长沙 410013

真菌竹黄(Shiraia bambusicola)是一种传统的民间中药，具有补中益气、祛风利湿、抗菌消炎等功效，是一种非常值得开发利用的药用真菌资源［1］。临床上竹黄主治风湿性及类风湿性关节炎、跌打损伤、腰肌劳损、筋骨酸痛等［2］，其所含组分或成分，显示了较强的药理作用，具有保肝护肝、抗氧化、促凋亡、抗病毒、抗菌和抗肿瘤等功能［3-6］，其作用的有效部位、活性成分及作用机理等方面的研究尚处于起步阶段。

肿瘤与炎症具有非常紧密的关系，肿瘤与炎症之间是一条双向道:一方面炎症对肿瘤发生具有促进作用;另一方面，肿瘤也可引发炎症，彼此的信号通路之间存在着强烈对话，形成复杂的信号网络系统［7，8］。肿瘤坏死因子 α(TNF-α)是一种主要由单核-吞噬细胞产生的细胞因子，可激活细胞凋亡和炎症应答等信号通路，这些信号通路之间相互关联相互制约，对细胞的最终效应取决于占主导地位的通路［9，10］。TNF-α 相关信号通路在肿瘤和炎症之间的相互诱发、肿瘤及炎症相关疾病治疗过程中都起到非常重要的作用，是连接炎症和肿瘤的一个调控关联子［11］，介导肿瘤和炎症信号通路之间的对话过程。

竹黄既具有抗炎特性又可以发挥抗肿瘤功能，而TNF-α信号通路与炎症和肿瘤密切相关，我们推测竹黄的活性组分可能对TNF-α信号通路系统起到干预作用。最新研究也表明，成纤维细胞不仅在伤口愈合、组织缺陷和骨创伤修复等过程中发挥着积极作用，其也能对身体产生危害，与肿瘤生长与炎症发生密切相关［12］。因此，我们以TNF-α诱导小鼠成纤维细胞(L929细胞)为模型，探讨竹黄对该模型的作用方式，所涉及的TNF-α通路是肿瘤和炎症相关信号网络系统的重要组成部分。研究发现，真菌竹黄可以双向调节TNF-α诱导的L929细胞凋亡过程，高浓度竹黄提取物协同TNF-α诱导L929细胞凋亡;低浓度竹黄提取物可能通过抑制COX-2表达和促进BCL-2表达等作用抵抗TNF-α诱导L929细胞凋亡过程。

1 材料及方法

1.1 索式提取法获得竹黄总提取物

竹黄子座于60℃恒温干燥箱中干燥至恒重，然后粉碎成粉末。称取10 g竹黄粉末用滤纸包好，置于索式提取器中，加入75%的乙醇，样料比为1∶6，电热套加热至提取器中回流的液体液体颜色很浅。收集红色液体于旋转蒸发仪中浓缩提取液，将浓缩的提取液置于皿中，放在恒温干燥箱中60℃干燥至恒重膏状，称取药膏质量。恒重竹黄药膏加入DMSO溶解，配成50 mg/mL的药物原液，4℃保存，实验时按所需的工作浓度进行稀释。

1.2 细胞培养

L929细胞以RPMI1640培养基中(含10%新生小牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)培养，置于5%CO2、37℃培养箱中生长，3～4 d传代1次。用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的L929细胞，消化90 s，去掉胰酶加入新鲜培养基，用弯头吸管将细胞消化下来，收集于离心管中，取适量细胞悬液于血细胞计数板，进行计数，以每孔1×104细胞接种96孔板。待镜下观察细胞贴壁后，弃掉培养液，加入含有药物的培养液培养细胞3 d。

1.3 细胞形态观察和Hochest33258荧光染色

取对数生长期的L929细胞经胰酶消化，计数，以5×104细胞/孔接种6孔板中培养，待细胞长至50% ～80%满时，加入各设计浓度组处理细胞48 h。处理完毕，吸尽培养液，加入0.5 mL含4%多聚甲醛或70%乙醇的固定液，固定30 min。去固定液，用 PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次 3 min，加入 0.5 mL Hoechst 33258染色液，避光染色5 min。去染色液后，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3 min。最后每孔加入0.5 mL PBS在倒置显微镜下观察;荧光显微镜下用紫外光激发，可检测到呈蓝色的细胞核，凋亡细胞的核比正常细胞小，且亮度高。

1.4 磺酰罗丹明B(SRB)法绘制细胞生长抑制作用柱状图

首先，弃掉培养基，每孔加入预冷的 100 μL10%三氯醋酸(TCA)溶液，4℃固定1小时，弃掉TCA固定液，1%醋酸溶液洗涤3遍，自然干燥后，每孔加入100 μL 0.4%SRB 染液，室温染色 30 min，用1%醋酸溶液洗3遍，洗掉未与蛋白结合的染液，自然干燥后，加入150 uL 10 mM Tris碱液(pH10.5)溶解。置摇床上低速振荡10 min后，在酶标仪上用OD490 nm波长测量各孔的吸光值。

根据吸光值计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率=(1-试验组 A490/对照组 A490)×100%，实验重复3次，应用SPCC统计软件进行统计分析。以药物浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制作用柱状图。

1.5 Western Blot实验

等量的细胞总蛋白提取物，进行SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上，然后进行丽春红染色、脱色，确定转膜成功后，脱脂奶粉封闭过夜。TBS洗涤三次后，加一抗，于37℃ 温育2 h，TBS洗涤三次后，再加二抗，于37℃ 温育2 h，TBS洗涤三次后进行ECL化学发光、显影、定影。实验以β-actin蛋白为内参。

2 实验结果

2.1 竹黄对L929细胞的影响

Hoechst染色后，在荧光显微镜下观察:阴性对照组细胞大小均匀，边缘清晰，细胞排列紧密，在紫外激发下可见细胞核呈均质的蓝色(图1A，a);TNF-α(4 ng/mL)组细胞大量死亡，细胞密度急剧减小，细胞缩小，荧光显微镜下可见细胞核呈碎块状致密浓染(图1B，b)，为典型的凋亡形态;120 μg/mL竹黄组细胞变圆缩小，紫外激发可见与TNF-α(4 ng/mL)组相似的核凝缩现象(图1C，c);60 μg/mL竹黄组有很多细胞浓缩变圆，但在紫外激发下，观察到细胞核略微变小，核染色均匀(图1D，d);30 μg/mL竹黄组(图1E，e)已经很难从形态学水平观察到与阴性对照组的区别。Hoechst实验结果显示，通过不同浓度竹黄与L929细胞作用发现，高浓度竹黄可以诱导L929细胞凋亡，而当浓度为30 ng/mL时，对细胞基本无影响。这一结果有利于我们选择合适的竹黄浓度(≤30 ng/mL)进行与 TNF-α(4 ng/mL)共同诱导实验，以探求竹黄参与TNF-α信号网络的具体作用机理。

图1 不同浓度的竹黄作用48 h后L929细胞的形态变化(×400)Fig.1 Morphologic changes of L929 cells after treatment with different concentrations of Shiraia extracts for 48 h(×400).

2.2 竹黄双向调节TNF-α诱导的L929细胞凋亡过程

应用SRB实验法，我们测量不同浓度竹黄提取物对TNF-α(4 ng/mL)诱导L929细胞凋亡这一模型的影响作用。在酶标仪上用OD490 nm波长测量各孔的吸光值，然后根据公式计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率=(1-试验组A490/对照组A490)×100%，见表 1。

表1 不同浓度的竹黄提取物对TNF-α诱导的L929细胞的影响，n=3)Table 1 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α，n=3)

表1 不同浓度的竹黄提取物对TNF-α诱导的L929细胞的影响，n=3)Table 1 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α，n=3)

*:P ＜0.05(SPSS软件分析).

竹黄提取物浓度(μg/ml)Concentration抑制率(%)60.77% ±0.38%15+4 ng/mLTNFα 0.281 ±0.002 49.07% ±0.38%7.5+4 ng/mLTNFα 0.311 ±0.004* 43.64% ±0.77%*3.75+4 ng/mLTNFα 0.313 ±0.005* 43.37% ±0.86%*1.88+4 ng/mLTNFα 0.329 ±0.003* 40.44% ±0.52%*0.94+4 ng/mLTNFα 0.309 ±0.002* 44.14% ±0.32%*0.47+4 ng/mLTNFα 0.291 ±0.022 47.35% ±3.97%0+4 ng/mLTNFα 0.287 ±0.006 47.99% ±1.02%0+0 ng/mLTNFα(对照组)Inhibition 30+4 ng/mLTNFα 0.217 ±0.002*吸光度A490值Absorbance 0.558 ±0.005 0

以药物浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制作用柱状图(图2)。研究发现，竹黄提取物在浓度0.94 ～7.5 μg/mL 范围内能减小TNF-α对L929细胞的抑制作用，且当竹黄浓度在1.88 μg/mL时，抑制效果最为明显，此时的抑制率与TNF-α(4 ng/mL)组相比下降15.8%;当浓度大于1.88 μg/mL时这种作用随竹黄浓度的增高而逐渐减小，当浓度小于1.88 μg/mL时随竹黄浓度的减小而减小。当竹黄提取物浓度为15 μg/mL或者0.47 μg/mL时与阳性对照组相比没有明显差异;而当竹黄浓度继续增大到达30 μg/mL时抑制率与TNF-α(4 ng/mL)组相比上升26.6%。

图2 不同浓度的竹黄提取物对TNF-α诱导的L929细胞的影响Fig.2 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α

2.3 竹黄对COX-2蛋白表达的影响

用Western blotting分析不同浓度的竹黄提取物通常情况下在大多数组织细胞中不表达或表达极低，受炎症或致癌物等刺激时表达迅速上调［18］。COX-2与炎症发生以及多种癌症的发生都密切相关，COX-2特异性抑制剂能减轻RA病人的症状并缓解RA引起的慢性疼痛［19］。在本研究中，TNF-α诱导L929细胞后，细胞内的COX-2表达量与阴性对照组比较显著提高;30 μg/mL与15 μg/mL竹黄实验组COX-2的表达量与TNF-α诱导组相比没有显著的差别，但 7.5 μg/mL 与 3.75 μg/mL 竹黄实验组的COX-2的表达量逐渐减弱，推测竹黄可能通过降低 COX-2的表达量进而抑制 TNF-α诱导的L929细胞凋亡。

BCL-2(B-cell lymphoma-2)基因首先是在B细胞滤泡性淋巴瘤中被发现的，过表达BCL-2抑制细胞凋亡［20］。实验结果表明，低浓度竹黄实验组与TNF-α(4 ng/mL)组相比，BCL-2的表达量显著增强。这一结果与细胞水平观察到的竹黄浓度在7.5～1.88 μg/mL 范围内降低TNF-α 对L929 细胞抑制率的现象是相一致的，表明在一定浓度范围内竹黄通过诱导上调BCL-2的表达来提高细胞的存活率，从而抵抗TNF-α对L929细胞的凋亡作用。

NF-κB是一种常见的转录因子，它的活化形式是异二聚体，通常包括P65和P50两个蛋白质亚单位，在许多慢性炎症疾病中的发生和发展过程中NF-κB都发挥着至关重要的作用，最终决定细胞命运的是 TNF-信号通路间的平衡［21，22］。在本实验中，与阴性对照组相比，各实验组NF-κB P65蛋白表达量均上升，说明NF-κB P65蛋白是TNF-α诱导L929细胞凋亡过程中的重要调控因子，但由于其表达量并没有随着抑制凋亡现象发生而改变，推测其可能不是竹黄干预TNF-α信号网络过程中的关键靶标蛋白，在竹黄抑制L929细胞凋亡过程中的作用不明显，相关分子机理需要进一步论证。

4 结论

研究结果表明，真菌竹黄中含有药理作用相反的活性物质，可以双向调节TNF-α诱导的L929细胞凋亡过程。通过深入探索其干预TNF-α信号网络平衡的作用机制，我们发现TNF-α信号通路中关键蛋白因子COX-2表达下降，BCL-2表达上调，而NF-κB基本没有变化，推测COX-2和 BCL-2蛋白是竹黄拮抗细胞凋亡过程中的关键靶标蛋白，相关研究为临床上竹黄发挥抗肿瘤和抗炎功效提供理论基础，也为运用生物活性导向技术，结合天然药物分离提纯技术，进行竹黄相关药物的筛选提供依据。

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