IGF－1修饰的神经干细胞对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的影响

杨华山 王金国 蒋莉莉 (郑州大学护理学院，河南 郑州 450052)

由于阿尔茨海默病(AD)患者脑内环境的改变，淀粉样β蛋白(Aβ)的沉积阻碍了内源性神经干细胞的增殖及分化为成熟的神经元，使退变或损伤的神经元得不到足够的修复〔1，2〕。胰岛素样生长因子(IGF-1)可调节神经细胞的生长、发育和分化。Mustafa等〔3〕发现家族性AD成员的IGF-1水平明显低于其家族中的健康成员。Rivera等〔4〕报道，AD患者的大脑组织中IGF-1及其受体的表达明显比对照组低，IGF-1受体阳性的细胞明显减少，且和疾病的严重程度有明显的相关性。在本室的前期研究中，构建了IGF-1基因的逆转录病毒载体，并转染了神经干细胞(NSCs)，发现在被pLXSN-IGF-1病毒转染过的NSCs中IGF-1基因有较高的表达〔5〕。本实验将IGF-1基因修饰的NSCs植入AD模型大鼠的侧脑室，观察其对AD模型大鼠学习记忆的改善效果，并检测IGF-1在动物体内的表达情况，旨在为NSCs移植和基因治疗AD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠(3～4月龄，体重260～320 g)，由郑州大学实验动物中心提供。取成功AD模型大鼠24只，分为AD模型组、NSCs组、IGF-1修饰的神经干细胞移植组(IGF-1/NSCs组)，另设正常对照组，每组8只。

1.1.2 主要试剂和仪器 IGF-1抗体均购自武汉博士德公司。Y型电迷宫(张家港生物医学仪器厂)、荧光显微镜(日本尼康E600)、大鼠立体定向仪 SN-2型(日本东京成茂科学器械研究所)。

1.2 方法

1.2.1 AD 模型制备 Aβ1～40溶于无菌生理盐水(2 μg/μl)，用前37℃孵育1 w以上，使其变为聚集状态。除正常对照组以外的三组大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉(3 ml/kg)，参照Paxinos大鼠图谱，选取双侧海马CA1区为注射靶区，具体部位见参考文献〔1〕。

1.2.2 脑内移植IGF-1基因修饰神经干细胞 造模8～10 d行脑细胞移植。移植前1 d，加入培养的NSC和IGF-1修饰的NSC 5 h，漂洗2遍后再用新鲜培养液培养16 h，收集并计数培养的NSC和IGF-1-NSC。利用大鼠立体脑定位仪进行脑室内移植，分别吸取 NSC和 IGF-1-NSC细胞悬液各5 μl(约3×105)，按选定的侧脑室坐标进针(AP:0.6 mm、L:1.5 mm、V:4 mm)，注射速度为 0.5 μl/mm，留针 10 min。

AD模型组则以相同的方法、同样的位点注入等量无菌生理盐水。正常对照组不施以任何处理。移植4 w后进行行为学检测和病理学观察。

1.2.3 AD大鼠行为学检测 采用Y型电迷宫:①学习能力测试:以大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区为正确反应，以连续10次中有9次(9/10)正确反应前所需的电击次数(即尝试次数)表示其学习获得能力。②记忆再现测试:上述达标大鼠休息24 h后，同法检测其记忆力。以达9/10标准前的尝试次数表示记忆再现能力。

1.2.4 免疫组织化学染色 迷宫试验结束后各组大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉(3 ml/kg)后，经主动脉相继灌注生理盐水100 ml、40 g/L多聚甲醛(4℃)350 ml。快速取脑，固定后于移植点附近做层厚10 μm冰冻切片，IGF-1一抗:兔抗IGF-1抗体，二抗:羊抗兔IgG。DAB显色5 min，苏木素复染2 min，染色后进行脱水、透明、封片。以PBS作为阴性对照。

1.2.5 移植后AD大鼠脑内病理改变 迷宫试验结束后各组大鼠经4%多聚甲醛灌注取脑，进行病理学观察。

2 结果

2.1 AD模型建立 模型组海马区椎体细胞明显减少，同时可见许多细胞体积缩小，胞核固缩，染色加深。细胞形态与正常海马神经元不同。显示模型建立成功。

2.2 不同实验组AD模型大鼠的行为学变化 与正常对照组比较，模型组大鼠空间学习能力、记忆能力均显著下降(P＜0.05，P＜0.01)。两个细胞移植组空间学习能力、记忆能力均显著高于模型对照组(P＜0.05，P＜0.01)，基本达到正常水平(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠空间学习和记忆能力的比较()

表1 各组大鼠空间学习和记忆能力的比较()

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

学习时间 正确记忆时间正常对照组 8 57.12±5.282) 8.50±0.672)组别 n AD模型组 8 98.62±7.69 3.80±0.55 NSCs组 8 72.47±6.371) 6.70±0.471)IGF-1/NSCs组 8 66.43±6.852) 7.50±0.592)

2.3 免疫组织化学染色 移植4 w后，IGF-1修饰的神经干细胞移植组大鼠在海马可见较多的IGF-1阳性细胞，主要分布在海马CA1、CA3区多形层和分子层及齿状回，呈点状沿多形层和分子层长轴分布，AD模型组大鼠海马CA1区多形层和分子层染色较正常组浅。见图1。

图1 各组免疫组织化学染色结果(×100)

2.4 移植后各实验组AD大鼠模型脑内病理改变 光镜下观察各组大鼠不同脑区病理形态学变化，常规HE染色正常对照组海马结构完整，细胞排列整齐，形态正常，分布均匀。NESs组和IGF-1/NSCs组海马可见少量胶质细胞增生，损伤的神经元开始修复;尤其以IGF-1/NSCs组明显，多数受损的神经组织得到修复接近于正常，少见细胞凋亡改变。模型组海马椎体细胞带紊乱、变稀、中断，同时可见许多细胞体积缩小，胞核固缩，染色加深。见图2。

图2 各组AD大鼠脑区病理改变(×100)

3 讨论

NSCs的发现使人们对神经系统再生机制和神经系统疾病的治疗均有了新的认识。NSCs因为具有强大的自我复制及产生多种不同类型子细胞的能力，使其成为良好的供者来源。IGF-1是一种多功能细胞增殖调控因子，其功能行使主要靠与IGF-1受体结合来完成。IGF-1受体在胚胎及成年大脑中广泛存在，表明它与中枢神经系统的生长发育关系密切。在老年动物中枢神经系统中，尤其是海马结构中IGF-1表达呈年龄相关性下降，而IGF-1有着类似于神经生长因子的促进神经突触形成和维持神经细胞功能的作用，可改善老龄动物的记忆，学习能力〔10〕。有研究表明外源性IGF-1通过催化乙酰胆碱的形成，保护胆碱能神经元，从而改善脑功能，提示IGF-1在以智能丧失和行为异常为主要表现的老年性痴呆的治疗中可能具有一定的临床意义。

本实验结果表明:大鼠海马CA1区注射Aβ后，大鼠的空间学习记忆能力明显下降，NSCs和IGF-1基因修饰后的NSCs移植后，AD模型大鼠的学习记忆能力有不同程度的改善，其中NSCs组两项指标与模型组大鼠比较有统计学差异，显示移植NSCs对AD模型大鼠的学习记忆力有一定的改善作用，这可能与NSCs分泌某些神经营养因子或增加脑细胞有关。IGF-1/NSCs组两项指标差异最为明显，都接近于正常组大鼠，它对基底前脑胆碱能神经元的保护作用也最强，这与移植细胞分泌有活性的IGF-1，促进海马胆碱能系的存活和修复有关。

1 Abrous DN，Koehl M，Le Moal M.Adult neurogenesis:from precursors to network and physiology〔J〕.Physiol Rev，2005;58(2):523-69.

2 Haughey NJ，Nath A，Chan SL，et al.Disruption of neurogenesis by amyloid-peptide，and perturbed neural progenitor cell homeostasis，inmodels of Alzheimer disease〔J〕.J Neurochem，2002;83(6):1509-24.

3 Mustafa A，Launfelt L.Decreased plasma insulin-like growth factor-1 level in familial Alzheimer disease patients carrying the Swedish APP 670/671 mutation〔J〕.Dement Geriatr Cogn Disord，1999;10(6):446-51.

4 Rivera EJ，Goldin A，Fulmer N，et al.Insulin and insulin-like growth factor expression and function deteriorate with progression of Alzheimer disease:link to brain reductions in acetylcholine〔J〕.J Alzheimers Dis，2005;8(3):247-68.

5 王 进，崔景彬，张亚卓，等.胰岛素样生长因子-1基因真核表达载体的构建〔J〕.解剖学报，2006;37(2):187-9.

6 Snnag WE，Lynch C，Thomton P，et al.The effects of growth hormone and IGF-1 defficency on cerebrobascular and brain ageing〔J〕.J Anat，2000;197(4):575-85.