枯草芽孢杆菌发酵鱼粉产蛋白酶及其酶解效果

卢珍华

(集美大学生物工程学院，福建厦门361021)

枯草芽孢杆菌发酵鱼粉产蛋白酶及其酶解效果

卢珍华

(集美大学生物工程学院，福建厦门361021)

为开发以鱼粉为原料的优质饲料蛋白源以及相关保健食品，开展了用不同鱼粉为氮源发酵枯草芽孢杆菌生产蛋白酶及其酶解效果的研究，比较了不同菌种的发酵效果，确定了最佳发酵时间.通过蛋白酶活性测定和氨基态氮含量测定分析了不同菌种的产酶能力和酶活性大小及其酶解效果.结果表明，用罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵商业化的工业菌种枯草芽孢杆菌产生的酶活性显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05)，发酵后上清液中的氨基态氮含量也显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05)，即工业化的枯草芽孢杆菌对不同鱼粉的发酵效果不同，罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.

枯草芽孢杆菌;鱼粉;蛋白酶;氨基态氮

0 引言

微生物蛋白酶均为胞外酶，与动植物源蛋白酶相比，它具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单快速的特点，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，同时易于实现工业化生产［1］.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是生产碱性蛋白酶的传统菌株，具有产蛋白酶量大，耐高温、高碱等特点，因此，对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点［2］.鱼粉是动物饲料中优质的蛋白质来源，同时，随着生物技术的发展，越来越多的以鱼粉为基础的酶解发酵产物如寡肽等被证明不仅发挥营养作用［3］，而且具有提高免疫力，改善动物胃肠道菌群结构等功能.并且极有可能作为保健食品的功能因子应用于保健食品，改善人的免疫力或辅助治疗高血压、糖尿病等［4］.本文通过比较不同来源枯草芽孢杆菌及其不同发酵条件下不同鱼粉的发酵效果，以探索获得高效蛋白酶及其酶解产物的途径.

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

枯草芽孢杆菌由集美大学生物工程学院发酵实验室提供，有工业菌种和非工业菌种2种.

种子培养基 (质量分数):牛肉膏1.0%，葡萄糖1.5%，NaCl 0.5%，pH=7.2，121℃蒸气灭菌20 min;发酵培养基 (1000 mL):牛肉膏0.1 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉1.0 g，葡萄糖0.5 g，氮源分别选择加工处理过的鳕鱼(Gadoux macrocephalus)、干燥的罗非鱼(Tilapia mossambica)、新鲜未干燥的鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)鱼粉各6 g，水，pH=7.2，121℃蒸气灭菌20 min.

1.2 主要仪器

7200紫外可见分光光度计 (上海第三分析仪器厂);HH.B11型恒温培养箱 (上海跃进医疗器械厂);HQ45B型恒温摇床 (上海科学院武汉科学仪器厂);SP－DJ系列垂直净化工作台 (上海浦东伟普净化设备厂);WH－1漩涡混合器 (上海沪西分析仪器厂);PHS－2C精密酸度计 (上海雷磁仪器厂).

1.3 发酵培养

从甘油管中取出保存的菌种，以划线形式接种于含氯霉素的固体培养基平板上，在37℃培养箱中培养约24 h.从平板上挑取单菌落接种于种子培养液内，37℃培养6 h.然后以10%接种量转接到含有50 mL培养液的250 mL三角瓶中，37℃培养.

1.4 酶活力测定

取发酵液于4000 r/min离心20 min，取上清液，采用Folin酚法测定蛋白酶活力［5］.酶活力单位定义为:在55℃、pH=10.0条件下，1 min水解干酪素产生1 μg酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位，以U表示.样品的酶活力 /(U·mL－1)=4AKn/10=2AKn/5.式中:A为样品平行实验的平均吸光度值;K为吸光常数，取134;n为稀释倍数.

1.5 培养液上清液氨基态氮含量的测定

样品液5 mL，加蒸馏水30 mL，用0.1 mol/L的NaOH溶液中和至pH=7.5，加入中性甲醛溶液10 mL摇匀，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至pH=9.2，根据消耗NaOH溶液毫升数计算氨基态氮含量.

1.6 统计分析

利用单因素方差分析法分析不同菌种、不同时间及不同氮源的发酵效果，差异显著则进行多重比较，应用SPSS17.0软件进行分析.

2 结果

2.1 不同菌种发酵鱼粉产蛋白酶的比较

以鳕鱼鱼粉为主要氮源，比较工业菌种和非工业菌种发酵后蛋白酶的活力，其结果如图1所示.工业菌种发酵44、52、60 h取样的蛋白酶活力显著高于非工业菌种(P＜0.05).

2.2 不同发酵时间对蛋白酶活力的影响

以鳕鱼鱼粉为氮源，工业菌种发酵，考察发酵时间与发酵产物蛋白酶活力的关系，其结果如图2所示.由图2可见，酶活力在发酵52～56 h达到最大，显著高于发酵48 h或60 h(P＜0.05).

2.3 不同鱼粉发酵效果比较

工业菌种发酵55 h，考察对加工处理过的鳕鱼鱼粉、干燥的罗非鱼鱼粉及新鲜未干燥的鲢鱼鱼粉的发酵效果，分别测定酶活力及发酵上清液中的氨基态氮.结果表明，枯草芽孢杆菌对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵中酶活力显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05)(见图3);枯草芽孢杆菌对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵后上清液中的氨基态氮含量显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05)(见图4).说明，工业化的枯草芽孢杆菌在本实验条件下，对不同鱼粉的发酵效果不同，对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉的发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.

3 讨论

研究表明，工业化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力显著优于天然菌株，而工业化的枯草芽孢杆菌对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉的发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.鱼粉是以蛋白质为主要成分的混合物，除氮源外的其他成分如碳源、添加剂等都对枯草芽孢杆菌的产酶能力有重要影响.发酵效果的主要表征即寡肽和氨基态氮的形成取决于微生物蛋白酶的产生效率及不同蛋白质基质的特性［6－7］，其中，在微生物发酵过程中，氮源的主要作用是作为微生物细胞物质和含氮代谢物的氮素来源的营养物质，氮源作为枯草芽孢杆菌发酵培养基的一个主要因素，在芽胞的形成上发挥着重要作用［8］.不同的蛋白质基质是影响发酵效果的主要因素［9］，不同豆类蛋白质的发酵研究表明，大豆和经油榨工艺后的豆饼豆粕产寡肽和氨基态氮的能力显著高于其他豆类及其副产品［10－11］.本研究表明，罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉以及鲢鱼鱼粉作为不同的氮源，经工业化的枯草芽孢杆菌发酵后，罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉相对鲢鱼鱼粉表现较高的酶活力(P＜0.05)，上清液中的氨基态氮也显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05).本研究还比较了不同菌株的发酵效果，工业化的菌株发酵效果显著优于自然菌株.相关研究报道了几株经基因重组技术改造的工业化菌株表达高活性的蛋白酶，显著提高了蛋白酶的活性和产量，利用该菌种进行的发酵试验表明，寡肽和氨基态氮均显著提高［12－13］.

本研究明确了枯草芽孢杆菌对不同鱼粉的发酵效果，为以鱼粉为原料的生物技术饲料和功能保健食品的开发奠定了理论基础，后续的研究需要明确发酵产物中寡肽含量及其基本结构，明确发酵产物的主要营养及保健功能.

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(责任编辑 马建华 英文审校 曹敏杰)

Production of Proteases by Fermentation of Bacillus subtilis with Different Fish Meals as Nitrogen Sources

LU Zhen－hua
(School of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China)

To get higher enzymatic activity of proteases produced by Bacillus subtilis by fermentation，different fish meals were used as nitrogen sources.The effects of fermentation time，as well as the difference between commercial and field strains on enzymatic activity were compared.The content of amino nitrogen in the broth of fermentation was also determined.The results suggested that commercial strain showed a better performance in the fermentation with the fish meal of tilapia and codfish compared to silver carp.During the fermentation of Bacillus subtilis using tilapia and codfish meal as nitrogen sources，higher enzymatic activity and content of amino nitrogen were observed.

Bacillus subtilis;fish meal;protease;amino nitrogen

Q 51

A

1007－7405(2012)04－0265－04

2012－03－31

2012－05－14

卢珍华 (1971—)，女，高级实验师，从事食品化学微生物方向研究.