新型纳米抗菌无机填料的合成及其抗菌性能的初步研究

吴峻岭 金婵媛 聂晓萌 周凯运 周传建

（1.山东大学口腔医院 口腔修复科；山东省口腔生物医学重点实验室，济南 250012；2.山东大学材料科学与工程学院 高分子材料研究所，济南 250061）

现有的绝大多数牙科复合树脂材料因没有抗菌性能，容易造成充填修复后患牙的继发龋、牙髓炎症等并发症，如何赋予复合树脂材料抗菌、防龋性能，有效抑制微生物、菌斑在其表面及周围的滋生和附着，提高临床治疗效果，是牙科材料的研究热点[1]。为了实现上述目的，研究者从不同方面进行了尝试，如通过直接向树脂基体中加入抗菌成分，或通过在树脂基质上键合抗菌官能团等方法，来抑制细菌滋生等[2-3]。这些方法虽取得了一定的效果，但如何进一步提高树脂的抗菌性能依然是摆在研究者面前的一个课题。季铵盐作为一类广谱抗菌化合物，在抗菌领域具有广泛的应用，将高分子季铵盐与无机颗粒复合可以制成非缓释型抗菌材料[4]。如果将具有抗菌作用的无机填料添加到树脂中去，牙科树脂的抗菌性能将得到改善；另外，通过对季铵盐结构的设计还可以实现对某些菌类的专一抑制，这更有利于开发新型抗菌牙科树脂。纳米二氧化硅在树脂中具有良好的分散性和耐磨性，在其表面还存在部分活性羟基，非常有利于表面修饰。

基于此，如果将抗菌性能好、效果持久、毒性低的季铵盐结构作为抗菌成分，以适当的方法将其键合于纳米二氧化硅表面，形成抗菌颗粒，再添加到树脂基体中去，赋予牙科复合树脂优异抗菌、防龋性能，则有望解决传统复合树脂在实际临床应用过程中无抗菌防龋性能的弊端，满足临床需要。本研究旨在通过一系列方法制备表面枝接季铵盐化合物的纳米SiO2抗菌颗粒，并研究其特性，为实现牙科复合树脂抗菌性能提供新的途径。

1 材料和方法

1.1 主要材料及设备

M5型纳米二氧化硅（卡博特公司，美国）：纯度99.99%，粒径20 nm。变异链球菌ATCC 25175（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供），TSA、TSB培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司），DF101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（西安爱信仪器有限公司），RE-52CS2型旋转蒸发器（上海隆拓仪器设备有限公司），AVATAR 360型傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet公司，美国）。

1.2 目标产物的设计与合成

在参考相关研究[5-6]的基础上，制定了有机合成的思路：将含有机硅基团的γ-氯丙基三甲氧基硅烷碘代后与三乙胺反应形成季铵碘盐，再枝接到纳米二氧化硅表面，生成季铵盐修饰纳米二氧化硅抗菌颗粒。

1.2.1 N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化铵的制备 将γ-氯丙基三甲氧基硅烷、碘化钠按照摩尔比1.1∶1的比例加入装有温度计、磁力搅拌棒、冷凝装置、氮气密封的四口烧瓶中，以乙醇作为溶剂，加热至80℃并使乙醇回流1～2 h，然后按照硅烷与叔胺摩尔比为1∶1的比例加入三乙胺，继续回流36 h。真空抽滤，再减压蒸馏，得到淡黄色黏稠液体，即季铵盐：N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化铵。

1.2.2 季铵盐修饰纳米二氧化硅的制备 按每0.05mol的季铵盐需加入3 g二氧化硅的比例，将制备好的季铵盐与纳米二氧化硅颗粒以及溶剂乙醇一并加入装有温度计、磁力搅拌棒、冷凝装置、氮气保护的四口烧瓶中，加热搅拌回流反应6 h，蒸出溶剂，将剩余物用滤纸包好，放入索氏抽提器中，用乙醇萃取24 h，取出并烘干，得到季铵盐修饰纳米二氧化硅颗粒。

1.3 季铵盐及季铵盐修饰纳米二氧化硅结构的表征

采用红外光谱分析进行合成产物的结构表征和鉴定。液体（季铵盐）采用涂膜法；固体（季铵盐修饰纳米二氧化硅颗粒）采用KBr压片法，同时选择表面未枝接季铵盐化合物的纳米二氧化硅颗粒作为对照。测试条件为：扫描次数32，分辨率4 cm-1。

1.4 抗菌性能的检测

采用培养法定性检测目标产物的抗菌性能。根据预实验的结果，实验组取0.1 g季铵盐修饰纳米二氧化硅颗粒，加入到100 mL TSA培养基中，超声充分震荡分散后，于培养皿内铺板。对照组则不添加任何成分，过程同上。调整TSB液体培养基中隔夜培养的变异链球菌菌悬液浓度至2.4×108CFU·mL-1，将原液用10倍系列稀释法稀释为原液的1/100 000，作为实验用菌悬液。取实验用菌悬液0.1 mL，分别接种于实验组和对照组TSA固体培养基表面，微需氧（80%N2、10%CO2、10%H2）培养48h，菌落计数。为减少实验过程中的误差，每组做5个平行试验，所有操作均由同一人完成。

1.5 统计分析

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行校正t检验分析。

2 结果

2.1 红外光谱分析

季铵盐的表征与鉴定：图1为季铵盐N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化铵的红外光谱图，在1 385.80 cm-1处出现了与正氮离子相连的-CH2（即季铵基团中的C-N键）的特征吸收峰，是发生季铵化反应生成季铵盐的重要证据；同时在2 970.86 cm-1处为-CH的振动吸收，在3 342.20 cm-1处为Si-OH的吸收，说明在反应过程中有部分的硅烷氧基发生了水解，这些都证明反应生成的产物为季铵盐。

季铵盐修饰纳米二氧化硅的表征与鉴定：图2为季铵盐修饰的和未修饰的纳米二氧化硅颗粒的红外光谱图，曲线2在3 427.89 cm-1处出现较强的吸收峰，是二氧化硅颗粒表面羟基的吸收峰；而曲线1在3 427.89 cm-1处的峰明显减弱，是由于二氧化硅颗粒表面的羟基与硅烷氧基发生反应而减少，同时在2 973.21 cm-1处出现烷基的吸收，这些都说明季铵盐已经键接到二氧化硅颗粒表面。

2.2 抗菌性能

实验组与对照组的菌落计数分别为148.40±11.41和17.40±2.88，因两组方差不齐，故采用校正t检验分析，结果显示实验组抗菌效果明显（t’=24.88，P＜0.01），说明季铵盐修饰纳米二氧化硅颗粒对变异链球菌有较强的杀菌性能，具有良好的抗菌性。

图 1 季铵盐红外分析光谱图Fig 1 Infrared spectrum analysis figure of quaternary ammonium salt

图 2 季铵盐修饰的和未修饰的纳米二氧化硅颗粒的红外光谱图Fig 2 Infrared spectrum analysis figure of nano-silica particle grafted and no grafted with quaternary ammonium salt

3 讨论

3.1 牙科复合树脂抗菌性研究现状

如何使现有的牙科复合树脂材料具有抗菌性能，是当前口腔材料学领域研究的一个重要方向。学者主要从添加抗菌剂和组分改性两个方面进行了探索。添加抗菌剂主要是通过向树脂基质中加入无机或有机抗菌成分，然后通过抗菌成分的缓慢释放来达到抗菌的目的。如Bürgers等[2]将银颗粒添加到牙科复合树脂中，不但降低了变异链球菌在试件表面的黏附，而且显示了良好的抗菌性能。但是抗菌剂释放时会存在药物的溶出使基体材料的物理结构受到破坏而机械性能降低。有报道[7]显示，向复合树脂中添加一定量的氯己定虽然会赋予其抗菌性，但是同时也降低了材料的机械强度，这可能与抗菌因子的溶出造成了材料的多孔结构有关。此外，机械添加抗菌成分还存在药物释放的持久性不足、抑菌效果下降、时效性短，甚至是抗菌颗粒的释放而带来潜在毒性的弱点。树脂组分改性则是在树脂单体上键合季铵盐、苯酚等有机抗菌官能团，形成非溶出性抗菌剂，抗菌官能团与树脂单体靠化学键连接，直接对黏附在树脂表面的细菌发挥作用，而不需要通过释放抗菌因子来达到抗菌效果，所以性能稳定，效果持久，几乎不存在因抗菌成分的释放而导致的毒性问题。在所有的有机抗菌官能团中，季铵盐化合物因抗菌范围广和抗菌效果好而经常被大家选用[8]。如Imazato等[3]首次将季铵盐类抗菌分子12-甲基丙烯酰氧烷基溴化吡啶盐键合到树脂基质单体上，制成非溶出性抗菌树脂。这种非溶出性抗菌材料的一大优点是抗菌作用持久且不影响材料的机械性能。尽管非溶出性抗菌树脂抗菌效果持久，但是由于抗菌成分键合到树脂基质单体上，在某种程度上仍然会影响到树脂基质单体的化学性质，减弱其固化的性能等[9]。综合国内外上述的研究基础，探索新的赋予牙科树脂抗菌性能的方法势在必行。无机填料作为复合树脂的另一个重要组成成分，其作用就是赋予材料良好的物理机械性能，减少树脂的聚合收缩等。若在其表面键合具有抗菌性的季铵盐化合物，再添加到树脂基体中，这样既可以保证不改变树脂基质单体的化学特性，同时又赋予牙科复合树脂抗菌防龋性能，这是牙科树脂抗菌性研究的又一个新的创意和崭新的思路。

3.2 新型纳米抗菌无机填料的合成及抗菌性能

季铵盐化合物是由铵离子中的4个氢原子被烃基取代而成，通式为（R4N）+X-，其中R为4个烃基，X多为卤族元素离子。如何将季铵盐的结构与二氧化硅的结构相结合是本研究要解决的首要问题，考虑到二氧化硅表面的羟基具有一定的活性，可以与烷氧基硅烷反应，从而实现化学键合，因此，本研究采用叔胺与烷氧基硅烷取代反应的途径。在本研究中，首先以γ-氯丙基三甲氧基硅烷为原料，与碘化钠反应，将氯原子取代为碘原子，而后合成了季铵碘盐：N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化铵，并由红外光谱分析（图1）得到了证实。而N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化铵中的甲氧基又与纳米二氧化硅粉体表面发生偶合反应，使得季铵碘盐牢固地枝接到二氧化硅颗粒表面，由图2可见，二氧化硅表面未枝接季铵盐基团之前存在大量的羟基（曲线2），而与季铵盐偶合以后羟基数量显著减少（曲线1）；同时由于新合成的季铵碘盐溶于有机溶剂，经过乙醇萃取后，未键合到二氧化硅颗粒表面的季铵碘盐会被溶解掉，这些都说明生成的季铵盐改性的纳米二氧化硅颗粒是一个牢固的整体，抗菌颗粒中的季铵盐与二氧化硅载体通过化学键紧密地结合在一起，不易脱落。若将其添加到复合树脂中去，可以随着树脂基体的磨耗，持续地发挥抗菌作用，这样既不影响树脂基质的化学特性，还能有效地克服机械添加抗菌成分存在的药物释放持久性不足、时效性短等弊端。

许多微生物细胞膜上的磷脂因氧化而带有负电荷，而带正电荷的季铵盐分子十分容易穿过网状多孔的细胞壁，并破坏细胞膜的完整性，使胞内维持生命活动所需的大分子如RNA、DNA、K+等释放出来，最终导致细菌死亡。Beyth等[10]直接将纳米级的季铵盐颗粒添加到复合树脂中，对变异链球菌显示了良好的抗菌性能，而肖玉鸿等[11]将季铵盐枝接到牙科常用的单体甲基丙烯酸酯基团上，制备出不同种类的牙用季铵盐类抗菌单体，对变异链球菌等细菌亦显示了良好的抗菌性。在本研究中，将自行合成的纳米抗菌无机填料季铵盐修饰纳米二氧化硅添加到细菌培养基中，并以龋病的常见致病菌变异链球菌作为研究对象，结果表明，与对照组相比，季铵盐修饰纳米二氧化硅显示了良好的抗菌性能（P＜0.01）。

当前，如何赋予牙科复合树脂长久的抗菌防龋性能，提高临床治疗效果，仍然是研究的热点和难点。本研究在参阅国内外最新相关研究进展的基础上，通过一系列的有机方法自行合成了季铵盐：N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化铵，并成功地枝接到纳米二氧化硅颗粒上，生成了纳米抗菌无机填料：季铵盐修饰纳米二氧化硅颗粒。经红外光谱分析证实，该方法简便有效。同时，还以变异链球菌为研究对象，定性分析了抗菌无机填料的抗菌性能，并且得到了有益的结论，为以后此方面的研究开辟了新的思路。

[1] Fan C,Chu L,Rawls HR,et al.Development of an antimicrobial resin—a pilot study[J].Dent Mater,2011,27（4）：322-328.

[2] Bürgers R,Eidt A,Frankenberger R,et al.The anti-adherence activity and bactericidal effect of microparticulate silver additives in composite resin materials[J].Arch Oral Biol,2009,54（6）：595-601.

[3] Imazato S,Torii M,Tsuchitani Y,et al.Incorporation of bacterial inhibitor into resin composite[J].J Dent Res,1994,73（8）：1437-1443.

[4] 吴远根,邱树毅,张难,等.季铵化聚乙烯亚胺/SiO2微粒的制备及其抗菌性能[J].化学工程,2009,37（1）：421-426.Wu Yuangen,Qiu Shuyi,Zhang Nan,et al.Preparation and bac-tericidal activity of SiO2microparticles grafted with quaternized polyethylenimines[J].Chemical Engineering（China）,2009,37（1）：421-426.

[5] 安秋凤,肖丽萍,黄玲,等.季铵化硅烷的合成与应用[J].有机硅材料,2003,17（4）：16-19.An Qiufeng,Xiao Liping,Huang Ling,et al.Synthesis and applications of quaternary ammonium silane[J].Silicone Material,2003,17（4）：16-19.

[6] 徐霞,杨秦欢,雷万学,等.季铵盐型纳米气相二氧化硅衍生物的合成、表征及生物学活性[J].光谱学与光谱分析,2006,26（3）：444-447.Xu Xia,Yang Qinhuan,Lei Wanxue,et al.Synthesis,characterization and antimicrobial activity of nano-fumed silica derivative with quaternary ammonium salts[J].Spectroscopy Spectral Analysis,2006,26（3）：444-447.

[7] Jedrychowski JR,Caputo AA,Kerper S.Antibacterial and mechanical properties of restorative materials combined with chlorhexidines[J].J Oral Rehabil,1983,10（5）：373-381.

[8] Antonucci JM,Zeiger DN,Tang K,et al.Synthesis and characterization of dimethacrylates containing quaternary ammonium functionalities for dental applications[J].Dent Mater,2012,28（2）：219-228.

[9] Jandt KD,Sigusch BW.Future perspectives of resin-based dental materials[J].Dent Mater,2009,25（8）：1001-1006.

[10]Beyth N,Yudovin-Farber I,Bahir R,et al.Antibacterial activity of dental composites containing quaternary ammonium polyethylenimine nanoparticles againstStreptococcus mutans[J].Biomaterials,2006,27（21）：3995-4002.

[11]肖玉鸿,陈吉华,方明,等.牙科季铵盐类单体的制备及其抗菌作用的研究[J].中华口腔医学杂志,2008,43（6）：370-373.Xiao Yuhong,Chen Jihua,Fang Ming,et al.Preparation and antibacterial activity of quaternary ammonium salt monomers[J].Chin J Stomatol,2008,43（6）：370-373.