新型多孔磷酸钙支架对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

王淑红 张雄 张劲娥 黄远亮，3

（1.同济大学 口腔医学院，上海 200072；2.杭州市第一人民医院 口腔科，杭州 310006；3.同济大学附属东方医院 口腔科，上海 200120）

与既往的组织移植、替代材料相比，组织工程技术为骨缺损提供了更理想的修复方法[1-2]，主要包括种子细胞和支架材料两部分。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨组织工程中较公认的种子细胞，目前的研究主要集中于其成骨潜能[2-3]；支架材料的研究则主要集中在多孔磷酸钙（calcium phosphate cement，CPC）、磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）等无机多孔材料及聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物[poly（lactide-co-glycolide），PLGA]、明胶海绵（gelatin sponge，GS）等高分子可降解材料领域[3-4]。每种材料各有优缺点，其中无机材料因为其良好的生物相容性而得到更多认可，但存在强度不足、降解速率过慢等缺陷，而多数高分子材料在降解过程中产生的中间产物引起的无菌性炎症显著阻碍了其广泛应用。目前为止，尚无一种支架材料能够满足组织工程化骨构建的所有要求。本实验所用的支架材料新型CPC是上海瑞邦生物材料有限公司的专利产品（专利号：ZL 021508852），是将CPC经过调整制备条件、浆体微结构、孔径和孔隙率等然后改性而成。本研究旨在探索新型CPC支架材料对BMSCs黏附、增殖及成骨分化的影响，为进一步的动物实验提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

DMEM培养基（Gibco公司，美国），胎牛血清（Hyclone公司，美国），地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C、茜素红（alizarin red-S，ARS）（Sigma公司，美国），青霉素和链霉素（Hyclone公司，美国）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（Sigma公司，美国）；新型CPC（上海瑞邦生物材料有限公司），PLGA、TCP（上海贝奥路生物材料有限公司）。

1.2 实验仪器

超净工作台，恒温细胞培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度，Thermo Forma公司，美国），一次性培养皿（Corning公司，美国），荧光显微镜（Hyclone公司，美国），倒置相差显微镜（inverted phase contrast microscope，IPCM）（Nikon公司，日本），紫外分光光度计（Beckman公司，美国）。

1.3 实验动物

1～1.5岁健康Beagle犬，体重10～15 kg，雌雄不限，要求为一级实验动物，由上海交通大学口腔医学院动物中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 BMSCs的培养与诱导 在全麻和无菌条件下，用18号骨髓穿刺针筒于Beagle犬髂前上嵴抽取新鲜骨髓4～5 mL，迅速加入含肝素的无菌离心管中，1 500 r·min-1离心10 min，在超净工作台内小心吸弃上层脂肪悬液，加入DMEM 20 mL吹打均匀后平均接种于两个直径为10 cm的培养皿中，于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养。待细胞在培养皿底部形成克隆时进行初次换液，细胞在培养皿底部融合超过70%～80%时首次传代。从第1代开始，换用添加成骨细胞诱导体系（包括0.1 μmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-磷酸甘油钠、50 μg·mL-1维生素C）的DMEM培养细胞[5]，选择第2～3代细胞进行后续实验。

1.4.2 BMSCs与支架材料的体外复合培养 选择第2～3代细胞，0.25%胰蛋白酶溶液消化、收集、离心并调整细胞密度为每毫升1×106。灭菌支架材料分3组：A组为CPC，B组为TCP，C组为PLGA；另设单纯培养细胞组作为对照（D组）。分别取支架材料预置于24孔板内，根据材料吸水度预实验的结果，每块材料滴加150 μL细胞悬液，共同培养24 h后加常量培养基，于不同时间点进行后续检测。

1.4.3 IPCM观察 逐日观察并记录各组支架材料表面BMSCs外观形态的变化及其贴壁、生长、扩增、分化、融合、钙化等状况。

1.4.4 生长曲线测定 细胞与支架材料共同培养后，每天从每组材料中取一块材料用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞并调节成1 mL细胞悬液后进行细胞计数。每组材料重复操作3次取平均值，绘制生长曲线，并进行统计学分析。剩余孔每3天换液。

1.4.5 ALP活性半定量检测 分别于共同培养7、10、14 d后将样本从培养液中取出，消化收集细胞，加入裂解液200 μL裂解4～6 h，震荡30 min后取10 μL放入96孔板中，每组设3个复孔，每孔加入200 μL蛋白质分析液后震荡5 min，630 nm处测光密度（optical density，OD）值。取100 μL细胞悬液放入96孔板，加入胶囊（ALP试剂盒里的固有组分）加缓冲液配成的反应底物100 μL，37℃水浴30 min后置于酶标仪上于405 nm波长下测定OD值。

1.4.6 骨钙素ARS染色 分别于共同培养14、21 d后将各组材料样本从培养液中取出，PBS冲洗2次，95%乙醇固定10 min，双蒸水冲洗3次，每次5 min，加0.1%ARS-Tris-HCl（pH值为8.3）于37℃水浴30 min，双蒸水冲洗干净多余染色剂后于光学显微镜下观察钙盐沉积及钙结节生成情况。

1.4.7 骨钙素半定量检测 分别于共培养14、21 d后将3组材料从培养液中取出，PBS冲洗2次，70%乙醇固定1 h，PBS冲洗5次，每次5 min，0.5%ARSTris-HCl（pH值为4.0～4.2）室温染色1 h后PBS孵育15 min，弃上清液后PBS冲洗3次，每次5 min，弃上清液后加入氯化十六烷基吡啶室温下孵育30 min，吸上清液，定样本的OD值（波长562 nm）。测定时用氯化十六烷基吡啶溶液调零，并同时测一组未加ARS的单纯细胞的上清液OD值。样本OD值=样本OD测定值-单纯细胞上清液OD值。每个样本重复3次取平均值。

1.5 数据处理与统计学分析方法

采用SPSS 17.0软件对检测结果进行方差分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 IPCM观察

初次换液可见BMSCs呈圆形半透明状，贴壁生长、增殖并形成散在克隆。BMSCs逐日增殖，约10 d后接近铺满培养皿底部，此时可进行首次传代。换用诱导型DMEM培养后，细胞慢慢向梭形或多边形转化，偶有突起，形态类似成骨细胞。接种于不同材料上的细胞均可在材料表面黏附并生长，共同培养72 h后形态如下：CPC组BMSCs较为伸展，形态与单纯培养组细胞相似；PLGA组BMSCs多为球形，生长状态较差；TCP组BMSCs形态介于上述两者之间，更接近于CPC组；散落在24孔板底壁细胞的生长形态与单纯培养组细胞的镜下形态相似（图1）。

图 1 共同培养72 h后BMSCs形态 IPCM ×40Fig 1 Morphological characters of BMSCs cultured 72 h IPCM ×40

2.2 生长曲线测定

BMSCs接种于支架材料上后，部分黏附于材料上开始生长、增殖，部分漏出在培养板底壁继续生长。细胞的生长曲线见图2：黏附于材料上的细胞数量随着时间的增加而增加，呈时间依赖性，7 d后进入平台期，其后增长趋势减慢；CPC组细胞数量最多，其次是TCP组，但两者之间的差异无统计学意义（P＞0.05）；PLGA组细胞数量最少，与其他两组的差异有统计学意义（P＜0.05）。该结果提示CPC材料黏附的细胞最多、细胞增殖最快。

图 2 BMSCs的生长曲线Fig 2 Growth curves of BMSCs

2.3 ALP活性半定量检测

ALP活性半定量检测结果见表1：CPC、TCP、PLGA组细胞均从7 d起表达出明显的ALP活性，随着培养时间的延长，ALP活性增强；CPC、TCP组ALP表达强度大于PLGA组，且有统计学意义（P＜0.05），但CPC与TCP组的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表 1 ALP活性半定量测定（OD值）Tab 1 Semi-quantitative measurement（OD value）of ALP ±s

表 1 ALP活性半定量测定（OD值）Tab 1 Semi-quantitative measurement（OD value）of ALP ±s

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2.4 骨钙素ARS染色

BMSCs在支架材料表面重叠生长，出现基质堆积和矿盐沉积现象。培养14 d时，钙结节ARS染色可见深浅不一的浅紫红色着色，表明有明显的钙盐沉积；培养21 d时可见多个形态各异、大小不一的紫红色结节，为钙盐沉积形成的钙结节；随着培养时间的延长，钙结节逐渐增大（图3）。无论是钙盐沉积还是钙结节生成，CPC和TCP组均明显多于PLGA组（P＜0.05），而CPC和TCP组之间的差异没有统计学意义（P＞0.05）。

图 3 3组的骨钙素染色情况 ARS ×40Fig 3 Osteocalcin staining of three groups ARS ×40

2.5 骨钙素半定量检测

骨钙素半定量检测结果见图4：14 d后各组细胞均有钙盐沉积，PLGA组钙盐沉积量明显少于CPC和TCP组（P＜0.05），而TCP和CPC组间的差异无统计学意义（P＞0.05）；21 d后各组细胞钙盐沉积量明显增加，无论是钙盐沉积还是钙结节生成，CPC和TCP组均明显多于PLGA组（P＜0.05），而CPC和TCP组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。该结果与钙结节ARS染色镜下观察结果一致。

图 4 骨钙素半定量检测结果Fig 4 Semi-quantitative measurement of osteocalcin

3 讨论

目前对骨组织工程中支架材料的研究热点集中于以CPC和TCP为代表的多孔无机支架材料、PLGA与聚己内酯（polycaprolactone，PCL）等可降解材料及两者的复合类材料[3-5]。20世纪80年代，Brown等[6]发现：某些磷酸钙盐能在人体环境和温度下自行不放热固化为羟磷灰石，由此开始将其尝试用于骨缺损修复。本实验选择上海瑞邦生物材料有限公司生产的新型CPC作为支架材料，与PLGA和TCP进行比较。该材料利用成孔剂的微溶解和产气剂的产气在常温下制备出多孔固化物，并针对传统CPC抗压强度不足、降解速率过慢等不足，调整材料的制备条件、浆体微结构、孔径和孔隙率等，并加以改性制成，有孔径大（为300～500 μm）、孔隙率高（约为70%）、抗压强度接近骨松质等特性，符合组织工程对于支架材料的要求。

对于种子细胞，不仅要求方便、易得，而且要求具有明确的成骨潜能[2-5]。目前已有多项关于脂肪干细胞、肌肉干细胞、牙髓干细胞、诱导多能干细胞等应用于骨组织工程的研究[7-9]，但BMSCs具有明确的多向转化潜能，可以通过简单的骨髓穿刺获得，培养时可贴壁生长以避免接触抑制，这些优势使其仍是重要的组织工程种子细胞之一。本实验参考其他学者[10-12]的研究，采用经典的全骨髓贴壁培养筛选法获得具有干细胞特征的种子细胞，进行材料与细胞的复合实验研究。

本实验将CPC等支架材料与BMSCs体外共同培养，通过观察细胞形态、绘制生长曲线，以及测定ALP和钙结节等方法检测新型CPC作为骨组织工程支架材料对BMSCs黏附、增殖及成骨分化的影响。通过观察细胞形态与生长曲线可以看出：黏附于新型CPC支架上的BMSCs形态较为伸展，与单纯培养组细胞相似，表明CPC支架材料对BMSCs的生长没有明显影响；PLGA组表面细胞多为球形，生长状态较差，可能是因为降解过程中的中间产物造成的无菌性炎症以及局部pH值的剧烈变化等原因阻碍了BMSCs的黏附与增殖；TCP组细胞形态和生长曲线都接近于CPC组，两组没有明显差异，说明TCP对BMSCs的黏附、生长影响较小。

ALP是成熟骨细胞的早期标志物[13]。本研究ALP检测结果表明：虽然CPC、TCP、PLGA组细胞均从培养第7天起明显表达ALP活性，随着时间增长活性均增强，但每个时间点CPC与TCP组细胞的ALP表达强度均大于PLGA组（P＜0.05），而CPC与TCP组之间则无明显差异（P＞0.05）。钙结节是成骨细胞分化成熟的标志，由钙盐逐步沉积而形成，一般钙化早期开始表达，成熟后达高峰[14]。本实验ARS染色结果同样表明：无论是钙盐沉积还是钙结节生成，CPC组和TCP组均明显多于PLGA组，而CPC组和TCP组之间没有显著差异。钙结节随培养时间的延长逐渐增大，半定量检测结果显示：PLGA组钙结节形成明显少于CPC组和TCP组，而TCP组与CPC组无明显差异。这一结果与ARS染色结果一致。

支架材料是细胞黏附、生长和矿化的场所。理想的骨支架材料要求具备以下特征：1）良好的生物相容性和表面活性，周围组织炎性反应小；2）具有可控且适宜的生物降解速度，最好与骨的生理性生成相匹配；3）具有合适的孔径、适当的孔隙率和渗透性；4）具有良好的骨传导性和骨诱导性；5）材料表面有利于细胞黏附和增殖[15]。本实验选用的新型CPC孔径为300～500 μm，孔隙率约70%，且孔与孔之间互相连通，呈现较为规则的三维多孔隙立体结构，符合骨组织工程支架材料的要求。与BMSCs共同培养后，经多项检测也表明：新型CPC材料为种子细胞的爬行长入、黏附、增殖及成骨作用的发挥提供了良好的三维空间环境。这也证明了BMSCs作为干细胞的成骨分化潜能和在组织工程化骨的构建中作为种子细胞的可行性。

本实验结果证明：新型CPC支架材料可以为种子细胞的生长提供适宜的局部环境，BMSCs可以在材料表面黏附、增殖、分化并发挥其成骨潜能。在现有的骨组织工程技术条件下，可以通过对Beagle犬BMSCs进行体外培养、诱导、扩增，并与新型CPC支架材料共同培养构建三维组织工程化骨。但就最终的体内植入而言，该类CPC材料还存在脆性较大、骨引导和骨诱导性不足等缺陷，应用基因重组、复合生长因子等高新技术以体外构建具有骨引导性和骨诱导性的真正意义上的三维结构组织工程化骨尚需要更为深入的研究[11-12]。

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