反胶束法提取红芸豆蛋白的前萃工艺优化

2012-09-06任海伟陈晓沛邢超红陈海秀

食品工业科技 2012年23期

任海伟，陈晓沛，张飞，邢超红，李雪，陈海秀

(1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050;2.甘肃圣源丽水环保科技有限公司，甘肃兰州730030)

芸豆(Phaseolus vulgaris Linn.sp.)学名菜豆，是普通菜豆(如小黑芸豆、小白芸豆等)和多花菜豆(如圆奶华芸豆 H、N、D、X 等)的总称，属豆科(Leguminosae)菜豆属(Phaseolus L.)的小宗杂粮作物。芸豆具有极高的营养和药用价值，蛋白含量20.29%～27.73%，脂肪含量1.02%～2.03%，VC含量1.88～1.96mg/100g，VB1含量 3.52mg/100g，VB2含量2.87mg/100g，Ca、Fe含量分别是鸡肉的7倍和4倍。中医理论记载，芸豆味甘平，性温，具有温中下气、利肠胃、止呃逆、益肾补元气等功效。研究表明，芸豆含有花色苷、皂苷等有效成分，能提高人体非特异性免疫，增强抗病能力，激活淋巴T细胞，抑制肿瘤细胞发展，受到医学界的广泛重视［1］。芸豆蛋白富含天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和亮氨酸等氨基酸，其氨基酸评分、化学评分和必需氨基酸指数均高于大豆蛋白或乳清蛋白，必需氨基酸组成符合FAO/WHO标准模式，是一种优质植物蛋白［2］。芸豆蛋白的等电点为4.7，相对分子质量约90.5～17.5ku，其贮藏蛋白主要是清蛋白(11.5%～31%)和球蛋白(46%～81%)［3-4］。芸豆蛋白具有紧凑的空间构象和较高的热稳定性，二级结构包括螺旋结构(16.5%)、β-类结构(52.2%)和无规则卷曲(31.0%)等［5］。反胶束是将表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中，并使其浓度超过临界浓度，碳氢链向外，亲水基向内组成，形成极性核内含有一定数量水的“微水池”，此“微水池”具有能够溶解蛋白质和氨基酸等极性物质的能力，是热力学稳定和透明体系［6］。反胶束溶液作为新的溶剂系统萃取分离技术，主要基于液-液相转移，具有萃取条件温和、产品纯度高、易保持物质活性等优点，常用于蛋白质、氨基酸、酶、细胞色素、生物碱等生物活性大分子的分离，在食品工业领域有良好的应用前景［7］。为充分利用红芸豆资源，本文拟考察AOT/异辛烷反胶束体系的含水量和稳定性，并通过探讨表面活性剂AOT浓度、缓冲液pH、KCl浓度和萃取时间等因素对红芸豆蛋白(RKBP)前萃率的影响，研究RKBP的反胶束萃取条件，以期获得较佳的前萃工艺条件，为进一步开发红芸豆杂粮资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

选取无霉变、籽粒饱满的红芸豆，经去皮、粉碎、烘干后过100目筛得到芸豆粉(以干基计，蛋白质含量20.4%)，备用。二-(2-乙基已基)琥珀酸酯磺酸钠(C20H37O7Na，AOT，纯度＞99%)上海邦成化工有限公司;牛血清白蛋白上海普飞生物技术公司;考马斯亮蓝(G-250)上海吉如生物科技发展有限公司;异辛烷、氯化钾等试剂均为分析纯。

DDS-11A数字电导率仪上海太普仪器有限公司;UV-9200紫外可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司;XH-C漩涡混合器江苏省金坛市医疗仪器厂;GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂;TG16-WS台式高速离心机湘仪离心机;SHZ-82气浴恒温振荡器江苏荣华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 反胶束体系含水量(W0)的研究预先配制不同浓度的AOT/异辛烷溶液，在磁力搅拌器高速搅拌下用微量注射器向AOT/异辛烷溶液中逐渐加入去离子水，待搅拌均匀后测试溶液电导率。根据W0=H2O的质量/AOT的质量，计算W0，绘制W0与电导率的关系曲线，确定各浓度条件下的临界含水量(Wc)。研究临界增溶水量(对应于Wc的水体积)与AOT浓度之间的关系，确定反胶束体系稳定的AOT 浓度范围［8］。

1.2.2 反胶束体系的制备准确称取一定质量AOT放入锥形瓶中，加入10mL异辛烷，磁力搅拌使其完全溶解，然后向溶液中加入1mL具有一定离子浓度和pH的KCl缓冲液，振荡器中振荡2h后5000r/min离心 20min，溶液若透明则为反胶束，反之则不是［9-10］。本实验用NaH2PO4-Na2HPO4缓冲体系调节KCl缓冲液浓度和pH。

1.2.3 反胶束法提取PKBP的前萃工艺取一定体积1.2.2中配制的反胶束溶液置于锥形瓶中，准确称取0.500g红芸豆粉加入反胶束体系中。以180r/min速度30℃恒温振荡一段时间，振荡后所得混合物转移至离心管8000r/min离心20min，得到前萃液。测定前萃液体积和前萃液中的蛋白质含量(以萃取前

分别研究 AOT 浓度 (0.25、1.00、1.25、1.50、2.00mol/L)、缓冲液 pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、KCl浓度(0、0.05、0.10、0.25、1.00 mol/L)和萃取时间(30、60、90、120、150min)4 个因素对 PKBP 前萃率的影响。在单因素实验结果基础上，选取影响较为显著的AOT浓度、缓冲液pH和KCl浓度3个因素进行L9(34)正交实验优化前萃条件，因素水平表见表1。的反胶束溶液作为空白样)，按照公式(1)计算前萃率［10］。

表1 因素与水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

2 结果与分析

2.1 AOT/异辛烷反胶束体系含水量(W0)的研究

反胶束体系是若干个纳米级大小的“微水池”，通过调节含水量(W0)即可改变反胶束的水池尺寸，进而使亲水性物质通过螯合作用进入“微水池”，达到萃取目的。W0越大则有机相所形成的反胶束微粒的直径越大，萃取能力越强。由图1可知，不同AOT浓度的反胶束体系，电导率均随含水量的增大而缓慢增加，当含水量增大到临界含水量(Wc≈55)时，电导率突然迅速增大。这是因为，当含水量较小时，水被油相包围在内核中，水相与油相之间是表面活性剂层，此时溶液的导电主要由被表面活性剂包裹的水核的运动和油相的导电所引起，所以电导率较小;当含水量逐步增加时，水核长大，间距变小，水核的运动和碰撞加剧导致电导率缓慢增加;当含水量超过Wc时，将会增强水与界面相作用，破坏反胶束结构，电导率急剧上升，体系变得很不稳定，甚至出现分相现象［8］。

图1 反胶束体系电导率与含水量的关系Fig.1 Relationship between electric conductivity and water content

由图2可知，随着AOT浓度的增加，反胶束体系中“微水池”数量增加，使体系的增溶水量显著增加。但如果AOT浓度大于2mol/L，即使增溶少量的水，体系的黏度也会大幅增加，并有大量悬浮液滴产生，同时，反胶束微粒间可能会产生强烈的相互作用，导致电导率极不稳定［8，11］。因此，本研究中AOT浓度范围应小于2mol/L，这与温宝妹［12］研究结果AOT临界胶束浓度为 2.014×10-3～2.975×10-3mol/mL相一致。

图2 AOT浓度与反胶束临界增溶水量的关系Fig.2 Relationship between AOT concentration and critical dissolved water

2.2 单因素实验

2.2.1 AOT浓度对RKBP前萃率的影响由图3可知，RKBP前萃率随AOT浓度增加而显著提高，这是因为当AOT浓度增加时，会形成一些含有大量水分子的更大的反胶束，这些反胶束与小的反胶束相比，在增溶蛋白质时，排除了由于蛋白质体积大而不能增溶的限制。但是，当AOT浓度增加到一定程度时，蛋白前萃率逐渐稳定甚至有下降趋势，这一现象可能是由于加入过量的AOT，导致反胶束体系的黏度增加，体系形成复杂的聚集体，对蛋白质的增溶产生妨碍作用，增加萃取难度［11，13］。因此，本实验 AOT 浓度初步确定为1.25mol/L。

图3 AOT浓度对前萃率的影响Fig.3 Effect of AOT concentration on forward extraction yield

2.2.2 缓冲溶液pH对RKBP前萃率的影响缓冲溶液pH对前萃率的影响主要是通过改变蛋白质分子表面的电荷分配。传统理论认为，蛋白进入“微水池”是由于蛋白质分子表面电荷与表面活性剂分子极性头所带电荷相反，由于相反电荷相互吸引使蛋白增溶。由图4可知，在pH6.0～7.5范围内，随着缓冲液pH的增加，蛋白前萃率逐渐增加，这与传统反胶束萃取理论相矛盾，该pH范围内蛋白质增溶可能是因为蛋白质分子和表面活性剂分子之间的疏水相互作用。当pH大于7.5后，蛋白前萃率有下降趋势，这是因为，AOT为阴离子表面活性剂，当缓冲液pH远大于红芸豆蛋白等电点(pI=4.5)时，蛋白质分子和AOT均呈负电荷状态，二者之间的静电斥力导致反胶束体系对蛋白的增溶作用降低或消失［14］。因此，本实验初步确定缓冲液pH为7.5。

图4 缓冲液pH对前萃率的影响Fig.4 Effect of pH on forward extraction yield

2.2.3 KCl浓度对RKBP前萃率的影响由图5可知，当KCl浓度从0增加到0.05mol/L时，前萃率逐渐增加，而随着KCl浓度的继续增加，前萃率反而下降。这是因为，一方面，盐浓度增大，离子强度越大，反胶束内表面双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的吸引作用，降低了蛋白质的溶解;另一方面，离子强度的增大也减弱了AOT极性基团之间的静电排斥作用，从而使极性基团易于相互接近而形成较小的反胶束，导致临界增溶水量减小，蛋白质溶解能力减弱［10］。另外，当离子浓度足够大时还会发生盐析现象或造成蛋白质的变性［15］。因此，本实验初步确定KCl浓度为0.05mol/L。

2.2.4 萃取时间对蛋白前萃率的影响反胶束体系的萃取过程一直处于不断地碰撞结合、分散、再结合、再分散的动态过程，促使“微水池”内外不断进行物料交换。从图6可以看出，随着萃取时间的延长，前萃率逐渐增加，但90min后前萃率逐渐趋于稳定。这是因为，一方面，反应起始时速率高，蛋白质能不断增溶于“微水池”，随着时间的延长，“微水池”内的蛋白浓度持续增加，蛋白质进入“微水池”的空间位阻相应增加;另一方面，原料中蛋白含量逐渐减少，蛋白质向原料表面迁移的速率也逐渐减小，这两方面的共同作用导致传质过程逐渐减慢，使得萃取速率降低并趋于稳定［16-17］。因此，本实验确定萃取时间为90min。

2.3 正交实验设计

在单因素结果基础上，以PKBP前萃率为指标，选取对前萃率影响较显著的AOT浓度、缓冲液pH和KCl浓度3个因素进行L9(34)正交实验，实验结果和方差分析见表2和表3。

图6 萃取时间对前萃率的影响Fig.6 Effect of time on forward extraction yield

由表2可以看出，3个因素对RKBP前萃率的影响大小顺序为A＞C＞B，即AOT浓度＞KCl浓度＞缓冲液pH，最优组合为A2B2C2。结合表3方差分析可知，AOT浓度对前萃率的影响极显著(p＜0.01)，其余两因素对前萃率的影响显著(p＜0.05)。因此，综合考虑，反胶束提取RKBP的最佳前萃条件为A2B2C2，即AOT浓度为1.25mol/L、缓冲液pH为7.5，KCl浓度为0.05mol/L。由于优化组合A2B2C2在上述9组实验中未出现，故对其进行验证实验。经验证实验表明，A2B2C2组合的前萃率为43.57%，均优于其他组合。

表2 正交实验设计与结果Table 2 Results and design test of orthogonal tests

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for forward extraction yield

3 结论

研究表明，AOT/异辛烷反胶束体系的临界增溶水量与AOT浓度呈正相关关系，不同AOT浓度对应的临界含水量值基本一致，即维持WC≈55不变。当AOT浓度大于2mol/L时，即使增溶少量水，反胶束体系的黏度也会大幅增加，电导率也极不稳定，因此本研究中AOT浓度上限为2mol/L。采用AOT-异辛烷-氯化钾组成的反胶束体系萃取RKBP的最优前萃条件为AOT浓度为1.25mol/L，缓冲液pH7.5，KCl浓度为0.05mol/L，萃取时间为90min，该条件下，前萃率可达43.57%。

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