响应面法超声波辅助提取双孢蘑菇蛋白工艺优化

马泽青，张宝善，赵舒欣，张云涛

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062)

双孢蘑菇［Agaricus bisporus(Lange)Sing.］俗称蘑菇、纽扣菇、白蘑菇或双孢菇，隶属于伞菌目(Agaricales)蘑菇科(Agaricacese)蘑菇属(Agaricus)。双孢菇蛋白质含量居食用菌之首，每100g干菇蛋白质在38～40g之间，双孢蘑菇中含有丰富的氨基酸，其含有的18种氨基酸中8种为人体必需氨基酸，包含在一般植物蛋白中缺乏的色氨酸和赖氨酸，必需氨基酸占总氨基酸的达40%，支链氨基酸比例也较高，芳香族氨基酸的比例较低［1］。近年来对食用菌的研究多在进行多糖等生物活性物质的提取［2-5］，食用菌中其他成分的功能性质研究相对较少。研究表明，一些食用兼药用真菌中的蛋白质和肽类可作为降血压功能食品进行开发［6］，因此研究开发提取食用菌中这些组分显得尤其有意义。本文采用超声波辅助水提双孢蘑菇蛋白，可利用超声空化作用而粉碎植物细胞、释放内容物，从而克服水提法时间长、效率低等缺点［7-8］。实验采取单因素实验和响应面法，以双孢蘑菇蛋白质提取率为指标，对影响超声波辅助水提双孢蘑菇蛋白的一些重要因素进行研究，以期为提高双孢蘑菇蛋白质的提取率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双孢蘑菇子实体 购于西安市朱雀农产品交易市场;牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、柠檬酸、氯化钠、抗坏血酸、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、无水乙醇、苯酚、浓硫酸 均为分析纯。

高功率数控超声仪 昆山市超声仪器有限公司;TDL-4离心机 上海安亭科学仪器厂;PL203型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;WFJ2000型可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;Kjeltec 2300型全自动凯氏定氮仪 瑞典福斯公司。

1.2 实验方法

1.2.1 双孢蘑菇蛋白质的提取工艺流程

1.2.1.1 原料 选择成熟适当，色泽洁白，菇形饱满圆整，新鲜无异味，无虫蛀，无锈病，无机械损伤，无杂质的菇体，购置后立即存放于4℃冰箱中保存。

1.2.1.2 护色 将双孢蘑菇浸泡在护色液中进行护色，护色液中添加0.6%柠檬酸、0.3%氯化钠和0.05%抗坏血酸［9］。

1.2.1.3 打浆 蘑菇切碎，加入一倍重量的水，打浆机打碎3～4min。

1.2.1.4 超声处理 蘑菇浆液按不同比例加水，用不同的超声温度、超声时间、超声功率提取双孢蘑菇多糖。

1.2.1.5 离心 先用200目尼龙网粗滤提取液，再利用离心机(3000r/min)离心蘑菇渣汁以进一步提取汁液。

1.2.2 蛋白质提取率测定方法

1.2.2.1 双孢蘑菇粗蛋白含量测定 参考GB/T 14771-1993。取待测样 1mL，加入 CuSO4·5H2O 0.7179g、K2SO46.2821g和浓硫酸12mL，于420℃消化1h，溶液澄清透亮时取出，冷却至室温待测。定氮系统HCl浓度为0.107mol/L。

1.2.2.2 双孢蘑菇提取液水溶性蛋白含量测定 超声提取离心后上清液的蛋白质含量用考马斯亮蓝比色法测定。以牛血清蛋白(BSA)为标准品，于595nm波长处测定吸光度，绘制蛋白质标准曲线如图1所示，建立回归方程为y=0.004x+0.006，其中y为吸光度，x为蛋白质浓度(μg/mL)，R2=0.999。

图1 蛋白含量标准曲线Fig.1 The standard curve of protein content

1.2.2.3 双孢蘑菇蛋白提取率计算 蛋白提取率(PE，%)=提取液蛋白质含量/原料粗蛋白×100

1.2.3 提取工艺

1.2.3.1 单因素实验 称取双孢蘑菇浆液10.00g，以超声功率(80、120、160、200W)、料液比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)、超声时间(10、20、30、40、50min)、超声温度(30、40、50、60、70℃)作为单因素实验条件进行超声波提取双孢蘑菇蛋白，超声提取后将上清液离心，测定上清液中蛋白质含量。

1.2.3.2 响应面优化实验 在单因素实验的基础上，综合考虑各因素对双孢蘑菇中蛋白质提取率的影响，采用统计分析软件建立四因素三水平的Box-Behnken模型，确定最优提取工艺。以双孢蘑菇蛋白质的提取率PE为响应值，提取温度(X1)、料液比(X2)、超声功率(X3)、超声时间(X4)为自变量，变量因素编码及水平见表1。

表1 超声法自变量因素编码及水平Table 1 Factors and levels in response surface test

1.2.4 数据分析方法 所有实验均进行3次重复，采用统计分析软件Design-Expert 7.0对数据进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声功率对双孢蘑菇蛋白质提取的影响 料液比为1∶3，超声温度为50℃，超声时间为20min，超声功率对双孢蘑菇风味物提取的影响结果如图2所示。

图2 超声功率对双孢蘑菇蛋白质提取率的影响Fig.2 Influence of ultrasonic power on Agaricus bisporus protein extraction rate

从图2可以看出，随着超声功率的增加，超声对细胞破壁作用增强，双孢蘑菇中水溶性蛋白的溶出也逐渐增大，PE逐渐提高。超声功率为120W时，PE值达到最大而后趋于稳定，因此选取80、120、160W继续对双孢蘑菇蛋白的提取做响应面分析以确定最佳超声功率。

2.1.2 超声温度对双孢蘑菇蛋白质提取的影响 料液比为1∶3，超声功率为120W，超声时间为20min，超声温度对双孢蘑菇蛋白质提取的影响结果如图3所示。

图3 超声温度对双孢蘑菇蛋白质提取率的影响Fig.3 Influence of ultrasonic temperature on Agaricus bisporus protein extraction rate

从图3可以看出，PE随着超声温度的增加而增大，在50℃时达到最大;此后，温度上升PE反而呈下降趋势。在温度相对较低的情况下，超声空化作用能促使蚕豆组织中蛋白最大限度溶出;当温度超过50℃后，高温会导致双孢蘑菇蛋白变性，降低酸沉率，从而使提取率下降。因此，选取40、50、60℃继续对双孢蘑菇蛋白的提取做响应面分析以确定最佳超声温度。

2.1.3 超声时间对双孢蘑菇蛋白质提取的影响 在料液比为1∶3，超声温度为50℃，功率为120W，超声时间对双孢蘑菇蛋白质提取的影响结果如图4所示。

图4 超声时间对双孢蘑菇蛋白质提取率的影响Fig.4 Influence of ultrasonic time on Agaricus bisporus protein extraction rate

从图4中可以看出，PE随着超声时间的延长而增大。PE在超声前10～20min迅速增加，20～40min变化不大，40～50min下降，主要因为超声空化作用能使双孢蘑菇蛋白在较短时间内最大限度溶出，之后提取率不再随时间的延长而增加，反而因长时间超声空化作用导致蛋白变性，使提取率呈下降趋势。因此，选取20、30、40min继续对双孢蘑菇蛋白的提取做响应面分析以确定最佳超声时间。

2.1.4 料液比对双孢蘑菇蛋白质提取的影响 超声温度为50℃，超声功率为120W，超声时间为30min，料液比对双孢蘑菇蛋白提取的影响结果如图5所示。

图5 料液比对双孢蘑菇蛋白质提取率的影响Fig.5 Influence of the material liquid ratio on Agaricus bisporus protein extraction rate

从图5可以看出，PE随着料液比的增大变化不大，综合考虑蛋白质提取率、加工成本及后续加工中浓缩工艺的需要，因此选取料液比 1∶3、1∶4、1∶5 继续对双孢蘑菇蛋白的提取做响应面分析以确定最佳料液比。

2.2 中心组合实验设计结果分析

响应面实验结果见表2，对实验数据进行回归拟合后，得到回归方程为:

表2 工艺参数响应面实验设计与结果Table 2 Design and results in response surface test of process parameters

表3为回归模型方差分析结果，回归方差分析显著性检验表明，该模型回归显著(p＜0.0001)，失拟项不显著，并且该模型=0.9941，说明该模型与实际实验拟合较好，能解释99.41%响应值的变化，仅有0.59%不能用该模型来解释;预测值与实测值之间有较好的相关性，实验误差小，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于双孢蘑菇蛋白提取工艺实验的分析和预测。

由表3方差分析结果可知，提取温度、超声功率和超声时间3个因素在实验过程中均起主要作用，对方程影响显著程度由大到小依次为超声功率、超声温度、超声时间和料液比，超声温度和超声功率对方程影响最显著，说明这二者直接关系蛋白质提取率的大小，而料液比的影响对蛋白质提取率的影响不显著。项影响极显著;项对模型的影响高度显著;X4、交互项X1X3对提取率的影响也达到了显著水平，表明各因素之间不是简单的线性关系，而是二次关系。

2.3 响应面结果分析

响应面分析结果如图6～图11。响应面图形是特定的响应值 PE与因素 X1、X2、X3、X4构成的三维空间在二维平面上的等高图。在每个响应面曲线中对2个因素进行分析，另外2个因素固定在零水平，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。从图中可看出拟合曲面有最大值，对拟合方程求偏导，可得出模型最大值，即为最优的实验方案。

表3 蛋白质提取率回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance to the rate of protein extraction

图6 温度与料液比互作用等高线和响应面图Fig.6 Respanse surface chart of temperature and solid to liquid ratio

图7 料液比与超声功率互作用等高线和响应面图Fig.7 Response surface chart of solid to liquid ratio and ultrasonic power

图6～图11中几个曲面图的极值点不明显，但可以较直观地看出实验设计的各个因素及其交互作用对双孢蘑菇蛋白提取率的影响，具有一定参考价值。

图8 温度与超声功率互作用等高线和响应面图Fig.8 Response surface chart of temperature and ultrasonic power

图9 温度与超声时间互作用等高线和响应面图Fig.9 Response surface chart of temperature and ultrasonic time

图6～图7表明料液比对双孢蘑菇蛋白提取率影响显著性不大，而超声温度和超声功率对提取率的影响较为显著，过高或过低的超声温度和超声功率都会使双孢蘑菇蛋白提取率降低，其中超声功率的影响更为显著，超声温度和超声功率存在最适值。图8～图10中等高线呈椭圆形，表示提取温度和超声功率两因素之间交互作用显著，相比较下，其他因素间交互作用较小。图11表明超声时间和料液比对双孢蘑菇蛋白提取率影响均不太显著，与方差分析结果相吻合。

2.4 响应面结果验证实验

图10 超声功率与超声时间互作用等高线和响应面图Fig.10 Response surface chart of ultrasonic time and ultrasonic power

图11 料液比与超声时间互作用等高线和响应面图Fig.11 Response surface chart of solid to liquid ratio and ultrasonic time

由模型方程计算可得，最优提取方案为超声功率130W，提取温度43.1℃，超声时间39.7min，料液比1∶5，双孢蘑菇蛋白理论最大得率为50.54%。根据实验情况将以上条件调整为提取温度43℃、料液比1∶5、超声功率 130W、提取时间 40min，重复 3 次实验，蛋白质平均得率为50.39%，与模型方程预测值基本一致。结果表明，该模型可以较好地反映出双孢蘑菇蛋白提取的条件，从而也证明了响应曲面法优化提取双孢蘑菇蛋白条件参数的可行性。

3 结论

通过单因素实验和响应面法优化超声波辅助提取双孢蘑菇蛋白实验，得到二次多项式回归模型(R2=0.9973)，探讨各因素间的交互作用，并对实验结果进行数学模拟和预测。最终确定了超声波辅助提取双孢蘑菇蛋白质的最佳工艺参数为超声功率130W，提取温度43℃，超声时间40min，料液比1∶5，双孢蘑菇蛋白提取率可达50.39%。

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