重组黑曲霉产大豆异黄酮糖苷酶发酵条件的研究

王丹

（1.吉林农业大学，吉林长春 130118；2.长春医学高等专科学校，吉林长春 130031）

近年来很多学者对大豆异黄酮开展了广泛而深入的研究，研究结果表明：大豆异黄酮是一类重要的生理活性物质，具有较强的生理功能，具有弱雌激素、抗氧化、抗溶血等活性，能够有效地预防和抑制骨质酥松、癌症和妇女更年期综合症等疾病的发生[1－2]；迄今为止，已知大豆异黄酮共有12种异构体，分为游离型的苷元和结合型的糖苷2类，其中苷元占总量的2%～3%，糖苷占总量的97%～98%。但天然糖苷类的分子结构并不是活性的最佳状态，具有生理活性的成分主要是大豆异黄酮苷元[3－4]；21世纪以来获得大豆异黄酮苷元的方法主要是酸解法和酶解法，但人们对酸解法得到的大豆异黄酮苷元的稳定性有所怀疑，二酶法由于具有反应条件温和，得到的大豆异黄酮苷元不易变形等优点，成为制备大豆异黄酮苷元的最佳途径。

迄今国内外对高产活性大豆异黄酮糖苷水解酶的研究正处于研制阶段，工业化生产还较为罕见[5]。本文试图探讨利用一株通过诱变得到的黑曲霉产大豆异黄酮糖苷酶产生菌，对其产酶的发酵工艺条件进行了研究，旨在为工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

黑曲霉诱变株：再生资源利用吉林农业大学食品生化与功能性食品实验室保藏菌株。

1.1.2 培养基

斜面培养基：20%马铃薯汁100 mL，蔗糖1.5 g，pH自然。

产酶基础培养基：麸皮 2.0 g，（NH4）2SO41.5 g，KH2PO40.05 g，水100 mL，pH自然。

1.1.3 主要试剂及仪器设备

水杨素：Sigma公司；其它试剂为分析纯。723分光光度计：上海棱光技术有限公司；PDX－650B恒温电热培养箱：沈阳市医疗器械研究所；SHZ－82A国华水浴恒温振荡器：中科院武汉科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 菌种的培养

将菌种接种到斜面培养基上，于28℃培养72 h。

1.2.2 液体发酵培养

将一定量的无菌水倒入斜面培养的菌液试管中刮洗，制得孢子悬液。将其定量加入到产酶基础培养基中，28℃、200 r/min振荡培养72 h。经过滤制得粗酶液，测定酶活力。

1.2.3 酶活力的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制

分别取 0.1%标准葡萄糖溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 于 50 mL 的编号为 1 号～11号得比色管中。向每支比色管中加入蒸馏水至2.0mL；再分别加入 2.0 mL DNS（3，5－二硝基水杨酸），沸水浴中显色5 min；迅速冷却后加蒸馏水定容至50 mL，用723分光光度计于波长510 nm处测定吸光度值。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3.2 大豆异黄酮糖苷酶活的测定

取经适当稀释的酶液0.1 mL，1%水杨素溶液（用pH4.6、0.1 mol/L醋酸缓冲液配制）0.9 mL，于50℃下保温30 min。用DNS法在510 nm处测定还原糖（以葡萄糖计），以灭活（100℃，10 min）的酶液作对照。

2 结果与分析

2.1 碳源对菌株产酶的影响

以产酶基础培养基为基础，改变其中碳源的种类进行产酶实验，结果见图1。

图1 不同碳源对菌株产酶的影响Fig.1 The effection of different carbon sources on enzyme production of strain

从图1可以表明该菌株可以利用玉米芯和麸皮作为碳源，而且以4%麸皮和2%玉米芯的复合碳源为培养基的产酶活性最好。利用玉米芯和麸皮这些农业生产的废弃物作为碳源对于该菌株的工业化生产大幅度降低成本具有一定的现实意义。

2.2 氮源对菌株产酶的影响

选择不同的氮源替代产酶基础培养基中的（NH4）2SO4进行试验，结果见图 2。

图2 不同氮源对菌株产酶的影响Fig.2 The effection of different nitrogen sources on enzyme production of bacteria

从图2可以看出，以豆饼粉和NH4Cl作为复合氮源时产酶活力最高。无机氮源的添加可以提高产酶，但当无机氮源添加量超过2%时对产酶不利。

2.3 接种量对菌株产酶的影响

分别以 6%、8%、10%、12%、14%的接种量在250 mL的锥形瓶中进行摇瓶实验，测定酶活力，结果见图3。

从图3可知，当接种量为10%时酶活力最高，接种量增加或减少，酶活力都会有不同程度地降低。

2.4 培养基起始pH对菌株产酶的影响

培养基的pH会影响细胞表面带电基团的解离及其微观结构，从而影响营养物质的吸收和代谢产物的分泌，导致微生物的生长和代谢发生改变。因此，调节培养基的起始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0进行产酶实验，结果见图4。

由图4可知，培养基起始pH为6.0较适合菌株的产酶。

2.5 培养时间对产酶的影响

将孢子悬浮液定量接入产酶基础培养基，培养24 h后开始测定酶活力，每隔12小时测定一次，直至96 h，结果见图 5。

表2 正交试验方案及结果Table 2 Orthogonal experimental program and results

从图5可知，培养36 h开始产酶，当培养72 h时产酶基本达到最高值。

2.6 不同因素对产酶的影响

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验，研究研究氮源、碳源、接种量和KH2PO4这4个因素对菌株产酶的影响，因素水平见表1。

表1L9（34）正交试验的因素和水平Table 1L9（34）orthogonal test factors and levels

通过极差分析方法可知，如表2所示，各因素对菌株产酶的影响的大小顺序为：氮源（B）＞KH2PO4添加量（D）＞碳源（A）＞接种量（C），正交结果显示，最优工艺组合为A2B2C3D3，经实验验证，此组合被确定为最佳工艺，即最佳产酶条件为：以麸皮和玉米芯为碳源，豆饼粉和NH4Cl为混合氮源，添加0.1%KH2PO4制备成pH为6.0培养基，接种量为10%，置于28℃的培养温度，200 r/min振荡培养72 h，可获得较高的产酶活性，可达 2.463×1010kat/mL。

3 结论与讨论

通过对利用野生型黑曲霉诱变菌株发酵生产大豆异黄酮糖苷酶的发酵条件进行优化的研究，初步确定培养条件为：培养基组分为麸皮4%、玉米芯2%、黄豆粉 2%、NH4Cl 2%、KH2PO40.1%，pH 为 6.0，接种量为10%，培养温度为28℃，72 h的条件下培养可获得较高的产酶活性，可达2.463×1010kat/mL。

该菌株可利用玉米芯、豆饼粉等工业生产的废弃料作为营养基质产生大豆异黄酮糖苷酶，有利于采用微生物法制备异黄酮苷元的工业产业化的推广，有一定的参考价值。

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[1]Adlercreutz H.Phytoestrogens:epidermiology and a possible role in cancer protection[J].Environ health perspect,1995,103(7):103－112

[2]LEE Y B,LEE H J,SOHN H S.Soy isoflavones and cognitive function[J].J Nutr Biochem,2005,16(11):693－699

[3]井乐刚,张永忠.微生物发酵制备大豆异黄酮的研究进展[J].微生物学通报,2003,30(2):86－88

[4]唐传核,彭志英.大豆蛋白水解物的苦肽以及脱除方法进展[J].中国油脂,2000,25(4):44－47

[5]孙艳梅,张永忠.水解制备大豆异黄酮甙元研究进展[J].食品研究与开发,2002,23(3):11－13