亲水色谱法测定甜叶菊叶片中糖苷含量

史一鸣，杨虹，李燕艳，杨天奎

（丰益（上海）生物技术研发中心有限公司，上海 200137）

甜叶菊糖苷（Steviol glycosides）是一种从甜叶菊茎叶中提取的天然甜味剂，被誉为“世界第三糖源”。与蔗糖、葡萄糖、甜蜜素、阿斯巴甜等甜味剂相比，甜叶菊糖苷具有热量小、甜度高、口感好、耐高温、稳定性高等特点[1]。1995年9月18日，FDA批准甜叶菊糖苷可以作为“膳食补充剂”进行销售和消费。2004年7月6日世界联合卫生组织正式通过允许甜叶菊糖苷在世界范围内通用的决议[2]。我国在GB 2760-2011《食品添加剂使用标准》中明确规定，甜菊糖苷作为甜味剂允许在蜜饯凉果、熟制坚果与籽类、糖果、糕点、调味品、饮料类、膨化食品生产加工中按生产需要适量使用[3]。这些都为甜叶菊糖苷的使用提供了安全证明。

甜叶菊叶片可以用来泡制茶饮，其甜味提取物甜叶菊糖苷耐热，酸碱条件下的性质稳定，有防腐等性能，所以可以被应用于食品工业上。其他工业领域中甜叶菊糖苷也已经广泛被应用，例如医药工业，它可作为矫口剂，应用在糖浆剂、散剂、片剂等制作上，还可作为降压剂、新陈代谢促进剂、强壮剂、减肥剂等[4]。日化工业中，甜叶菊糖苷应用在牙膏、漱口液等产品中可掩蔽某些配料的不良味感[5]。

甜叶菊中含有10种甜味成分[6]，因品种及种植环境的差异，含量有所不同。通常，蛇菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C为含量最多的三种糖苷[1]。

关于甜叶菊中糖苷含量的测定国内外有许多报道。如分光光度法[7]、薄层色谱法[8]、毛细管电泳法[9]、高效液相色谱法[10-15]等。

与其他方法相比，高效液相色谱法具有分辨率高、检测范围宽等优点。本文利用超声萃取技术、亲水色谱原理，建立了一种提取步骤简单且分析性能优异，能同时测定三种主要糖苷含量的液相色谱方法。经过方法学考察，杂质干扰低，分离度良好，回收率高，是准确可信的方法。用该方法对5种甜叶菊样品进行测定，得到了准确的样品数据，对甜叶菊在食品和医药工业中的应用具有一定的借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪（配在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器）；KuDos SK250H型超声清洗机；北京时代北利离心机；sartorius CPA225D型十万分之一天平；METTLER TLOEDO AB204-S型万分之一天平；BINDER FD115烘箱；IKA A11 basic粉碎机。

对照品：蛇菊苷（购自和光纯药工业株式会社，纯度＞99%）、莱鲍迪苷A（购自和光纯药工业株式会社，纯度＞99%）、莱鲍迪苷C（购自 ChromaDex，纯度=87%）。样品：甜叶菊1号样品（生产日期：2010-11-28，产自河北）、甜叶菊2号样品（生产日期：2010-11-02，产自安徽）、甜叶菊3号样品（生产日期：2009-07-15，产自江苏）、甜叶菊4号样品（生产日期：2010-10-26，产自云南）、甜叶菊5号样品（生产日期：2010-11-22，产自云南）。无水乙醇：分析纯（上海凌峰化学试剂有限公司）；乙腈：色谱纯（德国Merck）；双蒸水（丰益全球研发中心分析测试实验室自制）。

1.2 对照品溶液配制

取蛇菊苷对照品约50.0 mg，精密称量，置25 mL容量瓶中，用70%（g/g）乙醇/水溶液溶解，超声，稀释至刻度，浓度为2.0 mg/mL；取莱鲍迪苷C对照品约10.0 mg，精密称量，置 25 mL容量瓶中，用 70%（g/g）乙醇/水溶液溶解，超声，稀释至刻度，浓度为0.4 mg/mL；取莱鲍迪苷A对照品约62.5 mg，精密称量，置25 mL容量瓶中，用70%（g/g）乙醇/水溶液溶解，超声，稀释至刻度，浓度为2.5 mg/mL。配好的对照品溶液密封后置于4℃避光环境中保存。

1.3 样品制备

取甜叶菊叶片置于50℃避光环境下烘烤24 h至恒重，然后用粉碎机打碎，过80目筛，存放在棕色干燥器中。精密称取干燥的甜叶菊粉500 mg，置50 mL离心管中，精密加入20 mL 70%（g/g）乙醇/水溶液，在超声仪中超声30 min。然后取出，6 000 r/min离心5 min，吸取上清液。残渣中再次精密加入20 mL 70%（g/g）乙醇/水溶液，超声30 min。取出，6 000 r/min离心5 min。合并两次上清液于50 mL容量瓶中，用70%（g/g）乙醇/水溶液稀释至刻度，摇匀。吸取1.5 mL样品溶液，用0.45 μm针式微孔滤膜过滤后进样。

1.4 色谱条件

色谱柱：ZORBAX NH2（4.6×250 mm，5 μm），流速：1.0 mL/min，柱温：30℃，检测波长：210 nm，进样量：10 μL。流动相 A：水，流动相 B：乙腈，梯度洗脱，流动相梯度见表1，获得的对照品色谱图见图1。

表1 梯度洗脱时间表（体积比）Table 1 The schedule of gradient elution

2 方法

选取甜叶菊5号样品为考察对象，下文中所述样品未标明即为甜叶菊5号样品。

2.1 线性关系考察

将“1.2”项中蛇菊苷对照品溶液用70%（g/g）乙醇/水溶液稀释成 0.032、0.40、0.80、1.2、1.6、2.0 mg/mL 浓度；将“1.2”项中莱鲍迪苷A对照品溶液用70%（g/g）乙醇/水溶液稀释成 0.040、0.50、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL浓度；将“1.2”项中莱鲍迪苷C对照品溶液用70%（g/g）乙醇/水溶液稀释成 0.0032、0.040、0.080、0.12、0.16、0.20 mg/mL浓度。

吸取10 μL各浓度标准溶液进样，按“1.4”项所述液相条件测定，得到相应色谱峰的峰面积。以峰面积为纵坐标Y，溶液浓度（mg/mL）为横坐标X进行线性回归计算，得到蛇菊苷、莱鲍迪苷C和莱鲍迪苷A三种糖苷的回归方程如表2所示，结果表明，三者线性良好。

表2 三种糖苷回归方程Table 2 The regression equations of stevioside，rebaudioside C and rebaudioside A

2.2 精密度试验

吸取样品溶液，重复进样5次，每次10 μL，记录蛇菊苷、莱鲍迪苷C及莱鲍迪苷A峰面积。三者的RSD值分别为0.36%，0.87%，0.51%，结果表明，方法精密度良好。

2.3 重复性试验

称取样品3份，采用上述样品处理方法做平行测定，所得的蛇菊苷、莱鲍迪苷C及莱鲍迪苷A RSD值如表5所示，三者都小于5%，结果表明，方法重复性良好。

2.4 加标回收率试验

精密称取样品9份，按高、中、低3个浓度加入适量的3种对照品溶液，每个浓度3份。三者3个浓度的加标回收率在91%～104%之间，且RSD值小于5%。结果表明，回收率良好，方法准确。

3 讨论

3.1 提取方法选择

测定甜叶菊糖苷含量常用高效液相色谱法，其具有分辨率高、定量准确等优点，国内外有诸多相关报道，差别主要集中在提取方法与分析条件两个方面。

提取方法上，目前主要有超声提取法、索氏抽提法[10]、水浴震荡提取法[11-13]。索氏抽提法耗时较长，水浴加热震荡步骤较为繁琐，超声提取法具有高效、快捷、简单等优点，本文选择了超声萃取来提取甜叶菊中的糖苷物质。

在提取溶剂的选择上，文献报道的有甲醇[10]、乙醇水溶液[11]、沸水[12-13]等。本文对甲醇、乙醇、水、丙酮、乙醇/水溶液提取效率进行单因素试验比较，发现乙醇/水溶液效率最高。纯水或者乙醇做提取剂效率欠佳，而甲醇毒性较大。不同浓度的乙醇提取效率也存在明显差异，通过单因素实验考察，60%和70%质量浓度对莱鲍迪苷A提取效率最高。为了进一步确定最优条件，本文以莱鲍迪苷A含量为考察指标，对超声提取法中的液料比、乙醇浓度、提取次数三个主要因素设计正交试验L4（23），每组做3次平行，结果取平均值，各因素和水平选取结果如表3所示。提取时间通过单因素试验确定，选择30 min。正交试验结果如表4所示。

表3 超声提取正交试验因素水平表Table 3 Orthogonal test factors and levels of ultrasonic extraction

表4 正交试验结果Table 4 Results of orthogonal test

从表4中可以看出，极差从大到小依次为B＞A＞C，影响提取效果因素主次顺序依次为液料比＞乙醇浓度＞提取次数。提取三次和提取两次效果相当，所以选择提取二次。得到的最优组合为A2B1C1，即70%（g/g）乙醇为提取剂，液料比为40∶1，提取2次，每次30 min。按此最优组合条件测得的莱鲍迪苷A含量为4.29%，高于表4中所得实验数据，说明该条件提取效率最优。

3.2 液相分析方法选择

分析条件上，常见的色谱柱选择有C18柱或者氨基柱。国标GB 8270—1999《食品添加剂甜菊糖甙》中[14]介绍了测定甜叶菊糖苷纯度的液相方法，采用氨基柱，乙腈和水等度洗脱。利用该方法分析甜叶菊叶片糖苷提取液，如图2所示，糖苷峰和杂质峰不能够完全分离，干扰显著。尝试不同的乙腈和水等度洗脱比例，仍无法同时摆脱杂质对3种糖苷峰型的干扰，等度洗脱模式不能满足分析需求。

本文选择氨基柱，其硅胶键合氨丙基固定相能与羟基形成氢键作用，在乙腈/水为流动相的条件下分析极性碳水化合物，是一种亲水作用色谱方法。通过对等度洗脱条件的摸索，改变流动相乙腈和水的比例，发现杂质存在疏水性。提高流动相中乙腈比例，疏水性杂质能相对较早的被洗脱，而糖苷化合物因为氢键作用仍保留在固定相中。然后降低乙腈比例，提高流动相极性，糖苷化合物便被洗脱出来，从而降低了杂质的干扰。

在90%乙腈等度洗脱条件下，3种糖苷化合物在40 min内没有出峰，同时，疏水性杂质已经基本洗脱出色谱柱，然后，调整乙腈浓度到75%，3种糖苷化合物即刻快速的洗脱出色谱柱，如图2所示，分离度良好，达到了理想的分离要求。从3种糖苷化合物结构分析，莱鲍迪苷A分子中羟基最多，与固定相氢键作用最强，所以保留能力最强，因此，在该色谱条件下3种化合物的出峰顺序依次为蛇菊苷、莱鲍迪苷C及莱鲍迪苷A。

3.3 甜叶菊样品测试结果

对5种甜叶菊叶片进行糖苷含量测定。按“2”项中所述方法对不同品种叶片进行处理，每个品种取3份。按上述色谱条件分析，测定峰面积，代入回归方程，计算出含量，结果如表5所示。

表5 甜叶菊叶片中三种主要糖苷检测结果Table 5 The content of stevioside，rebaudioside C and rebaudioside A in different brands of Stevia Rebaudiana Bertoni

4 总结

在医药工业上，蛇菊苷在对分离的胰岛和β细胞具有直接的促胰岛素分泌效应，能明显降低血糖水平，抑制高血糖素分泌[15]，服用甜叶菊糖苷能够明显降低午餐后血糖的提高幅度[16]，因此富含蛇菊苷的甜叶菊具有很好的药用开发价值。通过测定糖苷组分含量，1号、3号、5号样品比较适合药物开发。与其他糖苷成分相比，莱鲍迪苷A的口感更接近蔗糖，并且甜度是蔗糖的450倍[1]，所以可以在食品工业中作为蔗糖的替代品。从实验数据看出，2号、4号样品富含莱鲍迪苷A，更合适作为食品添加剂来使用。

本文采用超声萃取法高效、快捷地提取出甜叶菊叶片中糖苷成分，利用亲水色谱原理排除杂质干扰，并很好的分离了3种主要的甜叶菊糖苷成分，是一种性能和适用性都较好的分析方法，本方法的建立对甜叶菊品质鉴定具有重要意义。

：

[1]郑建仙.低能量食品[M].北京:中国轻工业出版社,2001:103-110

[2]丁宁,郝再彬,陈秀华,等.甜叶菊及其糖苷的研究与发展[J].上海农业科技,2005(4):8-10

[3]中华人民共和国卫生部.GB 2760-2011食品添加剂使用标准[S].北京:中国标准出版社,2011:74

[4]倪军明,李军平.甜菊糖工业发展现状与前景[J].广州食品工业科技,2004,20(3):156-158

[5]鲍志华,王颖.天然甜味剂-甜菊苷[J].牙膏工业,1999(1):34-37

[6]Jan M C Geuns.stevioside[J].Phytochemistry,2003,64:913-921

[7]项秀珠,郭秀珠,黄品湖.甜菊苷含量的测定方法研究[J].浙江农业科学,1996(2):97-99

[8]滕祥金,杨丹,孟滕,等.薄板层析法分析甜叶菊糖苷[J].中国糖科,2007(4):24-31

[9]邵寒娟,胡涌刚,丁亮.毛细管电泳有效分离测定甜菊糖苷新方法的研究[J].分析科学学报,2001,17(2):127-130

[10]Makapugay H C,Dnanayakkara N P,Kinghorn A D.Improved highperformance liquid chromatographic separation of the Stevia rebaudiana sweet diterpene glycosides using linear gradient elution[J].Journal of chromatography,1984,283:390-395

[11]Kolb N,Herrera J L,Ferreyra D J,et al.Analysis of Sweet Diterpene Glycosides from Stevia rebaudiana:Improved HPLC Method[J].J A－gric Food Chem,2001,49:4538-4541

[12]Tomas Vanek,Ales Nepovom,Pavel Valocek.Determination of Stevioside in Plant Material and Fruit Teas[J].Journal of food composition and analysis,2001,14:383-388

[13]杨文婷,蔡乾蓉,徐应文,等.四川引种甜叶菊的糖苷含量变异及优良单株筛选[J].中国糖料,2010(2):27-34

[14]国家轻工业局,全国食品发酵标准化中心,卫生部食品卫生监督检验所,等.GB 8270-1999食品添加剂甜菊糖甙[S].北京:中国质检出版社,1999:2-3

[15]Jeppesen P B,Gregersen S,Alstrup K K,et al.Stevioside includes antihyper-glycaemic,and glucagonostatic effects in vivo:studies in the diabetic Goto-Kakizaki(GK)rats[J].Phytomedicine,2002,9(1):9-14

[16]Gregersen S,Jeppesen P B,Hols J J,et al.Antihyperglycemic effects of stevioside in type 2 diabetic subjects[J].Metabolism,2004,53(1):73-76