荧光分光光度计快速测定番茄酱中微生物数量

2012-09-05曹鹏杨瑞丽徐小琳薛梅

食品研究与开发 2012年12期

曹鹏，杨瑞丽，徐小琳，薛梅

（石河子大学化学化工学院，新疆石河子 832003）

新疆是中国重要的加工番茄产区[1-2]，番茄制品出口量约占全国的90%，为亚洲第一[3]，其产量逐年上升。

但由于检测手段不统一，效率低，准确性不高，番茄酱出口遭遇了越来越多的技术壁垒；特别是微生物的相关检验已不能满足国际市场的需求[4]。国家质量监督检验检疫总局虽颁发了SN/T2376-2009《番茄酱中主要腐败微生物的检验方法》，但其检测时间较长，仍属于事后检测的范围。在实际生产过程中，每有一个包装箱番茄酱质量出现问题，对工厂造成的直接损失约有4000元人民币[5]，因此迫切需要一种快速的、属于事中检测的微生物检验方法。目前微生物计数的常规方法有平板稀释计数法[6]、浊度法[7]、血球板计数法[8]、菌体干重法[9]等。第一种方法较繁琐，复杂性差，耗时长，不能及时反映菌体生长情况，不适合大批量检测使用；后几种方法不能有效的区分细胞的死活，无法准确的表示番茄酱中具有活性的微生物的数量，且受培养基、代谢产物的影响较大[10]，也不适合大批量的检测。

本实验使用荧光分光光度法检测番茄酱中的活性微生物，简单快速，灵敏度高，重现性好，适于工厂大规模检测的使用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番茄酱（新疆某番茄酱厂提供，灭菌，4℃密封保存）；供试微生物（从腐败番茄酱中筛选的嗜热耐酸杆菌，摇瓶培养 24 h）；吖啶橙（AO）（1×10-4mol/L，4 ℃封装保存，西安化学试剂厂）；十二烷基磺酸钠（SDS）（5×10-2mol/L，灭菌，室温保存，西安化学试剂厂）。

荧光分光光度计（F-2500）：日立；生物显微镜（XS-213）：江苏无锡冶金科技有限公司；血细胞计数板：上海求精生化试剂仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 番茄酱中微生物的分离

准确称取番茄酱1.0 g，加入15 mL无菌水，充分混匀，移取1.5 mL混合液于1.5 mL的离心管中；另取1.5 mL菌液于另一离心管中，设置一系列转速（600、800、1 000、1 200、1 400 r/min）和时间（2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 min）离心观察酱和菌的分离情况。

1.2.2 单因素和正交试验

秋风渐起，紫云内心崩溃了，找到夏梓桑，要了他的电话，委托他转交一封信，信中有一份离婚协议。回到住处，紫云赶紧收拾行李，重要证件都放进一个黑色LV公文包里，连夜离开上海。列车西去，夏梓桑在站台上向她挥手。

荧光分光光度计扫描吖啶橙溶液；激发波长为538 nm、发射波长为290 nm。依预实验结果设定初始条件为：番茄酱1.0 g加入15 mL无菌水中混匀成番茄酱液；锥形瓶中加入菌液1.0 mL、番茄酱液4.0 mL、SDS1.0 mL混匀，再加入0.3 mL～0.9 mL AO，最终加无菌水定容至8.0 mL；将其充分振荡并染色15 min后取1.5 mL进行离心；取离心后0.5 mL上清液微孔滤膜减压过滤；用5.0 mL无菌水清洗滤膜上的微生物于比色皿，并以525.5 nm处荧光值评价吖啶橙用量对测定效果的影响。

在上述得到最佳AO用量的基础上，其他条件不变，分别改变番茄酱液（1.5 mL～4.5 mL）、SDS（0.4 mL～1.6 mL）和染色时间（15 min～75 min），确定最佳番茄酱液用量、SDS用量和染色时间。并通过正交试验进一步确定最佳检测条件。

1.2.3 活菌数测定

取1 mL菌液加入到99 mL无菌水中，充分振荡15 min～20 min；用血细胞计数板法计数，根据菌液的稀释倍数，计算每毫升菌液中的菌数。

1.2.4 标准曲线

分别取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 的菌液，按最佳检测条件测定荧光值，以荧光值为纵坐标，每克番茄酱中的活菌数为横坐标，建立回归方程。

2 结果与分析

2.1 番茄酱与微生物的分离

由于番茄酱本身较黏稠，只有将微生物从番茄酱中分离出来，才能在分光光度计中测定。1 000 r/min离心5.0 min后，番茄酱能有效的沉淀；而菌液中的微生物基本不产生沉淀，可以达到较好的分离效果。

2.2 单因素和正交试验结果

不同吖啶橙用量对荧光值的影响结果见图1。

当AO含量较小时，增加AO用量可以提高荧光强度并在0.7 mL时达到峰值。随后随着AO浓度的增加荧光值反而下降。在溶液相中，AO存在单体与二聚体的平衡转化，而其二聚体不产生荧光；当AO浓度较大时，平衡向二聚体方向转化，体系荧光值就会降低。因此体系中吖啶橙浓度不宜过大，后续实验选择加入0.7 mL。

2.2.2 番茄酱液用量对测定效果的影响

不同番茄酱液用量对荧光值的影响结果见图2。

当番茄酱液用量较少时，增加番茄酱液用量可以提高荧光强度并在2.5 mL时达到峰值。增加番茄酱液用量提高了体系中微生物的数量，荧光值也随之加强。但是加入的番茄酱液过多后，体系的粘稠度快速增加，加大了离心分离微生物的难度，回收的微生物相对减少，荧光值也随之下降。因此后续实验选择加入2.5 mL番茄酱液。

2.2.3 SDS用量对测定效果的影响

不同SDS用量对荧光值的影响结果见图3。

当SDS含量较小时，增加SDS用量可以提高荧光强度并在0.6 mL时达到峰值。随后随着SDS浓度的增加荧光值反而下降。在无表面活性剂存在的情况下，AO以单体和二聚体的状态共存（以单体为主），当加入的SDS较低或较高时，体系中的二聚体比例增加，此浓度接近“预胶束”的生成浓度，在此阶段形成了微小分子集合体且主要以二聚体形式存在，二聚体无荧光，故荧光强度相对较低；当SDS的用量为0.6 mL时，“预胶束”大量生成，AO分子比较均匀地分配到这些集合体中，AO单体相应增加，二聚体减少，荧光强度升高[11]。后续实验选择加入0.6 mL SDS。

2.2.4 染色时间对测定效果的影响

不同染色时间对荧光值的影响结果见图4。

当染色时间较小时，增加染色时间荧光值反而下降，并于染色45 min后趋于平稳。由于番茄酱中成分较多，体系中的某些物质可能影响到了染料分子与菌体的结合，因此染色时间不宜过长，后续实验选择染色时间15 min。

2.2.5 正交试验结果与分析

在上述实验得出的较佳条件的基础上，进行正交试验，其结果如表1、表2所示。

表1 正交试验结果Table 1 The results of orthogonal experiment

由表1可知，荧光法快速测定活菌数的最佳组合为 A3B2C3D3，即吖啶橙用量 0.75 mL、染色 15 min、番茄酱液用量2.8 mL、十二烷基磺酸钠用量0.7 mL，各因素对荧光强度影响主次顺序为：吖啶橙﹥时间﹥番茄酱液﹥十二烷基磺酸钠；由表2的方差分析结果进一步可以看出，吖啶橙和染色时间对测定效果影响显著，而十二烷基磺酸钠和番茄酱对测定效果影响不显著。