大孔树脂纯化薰衣草总黄酮的工艺

赵军，谭为，徐芳，陈燕，顾政一，马龙

（1.新疆医科大学公共卫生学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室，新疆乌鲁木齐 830004）

熏衣草Lavandula augustifolia为唇形科熏衣草属芳香植物狭叶薰衣草的全草，广泛栽培种植于世界各地，具有消散寒气、补胃理脑、燥湿止痛之功效，用于治疗胸腹胀满、感冒咳喘、头晕头痛、心悸气短、关节骨痛等病症的治疗，被收载于《中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册》中[1-2]。据文献报道和前期研究结果显示，黄酮类化合物是薰衣草除精油外发挥药效的主要标识性化学成分，该类成分的研究已成为近年来薰衣草研究的热点[3-5]。大孔吸附树脂是一种具有吸附容量大、工艺流程短、易放大、再生容易等特点的分离材料，已被广泛用于中药有效成分的分离富集以及创新中药的研发之中[6]。本论文通过优选大孔吸附树脂富集薰衣草总黄酮的工艺参数，建立适合工业化生产的纯化工艺，为其进一步的新药开发提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

薰衣草药材购自新疆乌鲁木齐市维吾尔医院；芦丁对照品购自中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707；大孔吸附树脂 AB-8、D101、HPD100、HPD400、HPD450、HPD500 和 HPD750 购自沧州宝恩化工有限公司（使用前按产品说明进行预处理）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

岛津UV-2501PC紫外可见分光光度计：日本岛津有限公司；梅特勒AL204型电子天平：梅特勒-托利多上海有限公司；RE-5298A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

精密量取芦丁对照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 和6.0 mL，置于25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照紫外－可见分光光度法（附录ⅤA），在509 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为：y=0.525 1x－0.022 3（r=0.999 6），在 0.2 mg～1.2 mg 范围内线性关系良好。

1.3.2 上柱液的制备及总黄酮的含量测定

称取薰衣草药材粉末（过20目筛），加10倍量水，煎煮3次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩至一定量，即得。其总黄酮含量测定以标准绘制的方法的测定，按回归方程计算所含总黄酮的含量。

1.3.3 大孔吸附树脂型号的筛选

1.3.3.1 静态吸附行为的考察

称取不同型号大孔树脂各5.0 g，分别置250 mL三角瓶中，加样品溶液200 mL，每隔5 min振摇10 s，持续2 h，然后静置24 h，充分吸附后，滤过，测定吸附前后溶液中薰衣草总黄酮的含量，计算饱和吸附量：饱和吸附量=（原料液质量浓度×原料液体积－流出液质量浓度×流出液体积）/湿树脂的量。进一步，将吸附后的树脂装入层析柱中，先以水洗脱除杂，再以120 mL 70%乙醇溶液解吸，测定解吸液中薰衣草总黄酮含量，计算解吸率（%）。

1.3.3.2 动态吸附行为的考察

精密称取已处理好的7种树脂各10 g，装入直径2.0 cm的层析柱中，各加入75 mL样品液（3.17 mg总黄酮/mL）上样，用上样流出液在反复上样5次后，先以去离子水洗脱5 BV，再以70%乙醇溶液150 mL洗脱，上样洗脱流速均为1.0 mL/min，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，计算精制后薰衣草总黄酮的纯度和得率。

1.3.4 吸附与解吸工艺研究

通过上述实验，选择出一种较优的树脂，对最大上样量、上样流速、上样液的pH、洗脱剂乙醇浓度和流速以及洗脱除杂用水量进行考察，将预处理好的树脂湿法装入层析柱中，将薰衣草总黄酮提取液上柱，待样品溶液全部通过树脂柱后，用去离子水洗至流出液无色，再以不同浓度的乙醇以一定洗脱速度洗脱，收集洗脱液。通过测定总黄酮含量考察各因素对树脂吸附性能的影响。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂型号的筛选

大孔吸附树脂型号的筛选结果见表1、2。

表1不同树脂对薰衣草总黄酮静态吸附结果Table 1 Performance of adsorption and desorption for total flavonoids with various resins

表2 不同型号大孔树脂纯化得薰衣草总黄酮的纯度与得率Table 2 Purity and yield rate of total flavonoids though various resins

由表1、表2可知，7种树脂的静态吸附和解吸实验以AB－8的吸附量和解吸率均最高，每克树脂可以吸附9.563 mg薰衣草总黄酮，解吸率达到了78.17%；动态吸附以AB－8树脂获得薰衣草总黄酮的纯度和解吸率均最高，分别达到了62.35%和84.70%。因此，选定AB－8树脂作为薰衣草总黄酮富集纯化的最佳树脂型号。

2.2 AB－8大孔吸附树脂对薰衣草总黄酮的吸附与解吸工艺研究

2.2.1 最大上样质量的考察

将薰衣草总黄酮溶液（3.19 mg总黄酮/mL）150 mL缓慢加入装有10 g AB－8树脂的层析柱中，流速为1.0 mL/min，每树脂床体积（BV，15 mL）收集 1个流分，测定流出液中总黄酮的含量，以考察树脂的最大吸附量，结果如图1所示。

由图1可知，从第5个BV开始，总黄酮出现少量泄漏；10个BV时，AB-8树脂对总黄酮的吸附量达到饱和，即15 mL AB-8树脂达到饱和吸附时可吸附478.5 mg黄酮。为了避免造成总黄酮的泄漏，拟定最大上样量为12.76 mg/mL。

2.2.2 pH对吸附量的影响

以0.1%HCl及0.1%NaOH将上样液的pH调为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0，在相同条件下以1.0 mL/min的流速进行动态吸附，计算在不同pH下的动态吸附量，结果如图2所示。

由图2可知，在碱性条件下，薰衣草总黄酮可与碱形成盐，几乎不被吸附，pH=8时的吸附量仅为0.49 mg/mL。pH过小，可与酸形成垟盐，也不利于吸附。在弱酸条件下黄酮以分子形式存在，吸附量最大，在pH=6.0时达到11.18 mg/mL。因此选定上样液的pH为6.0左右，由于其本身pH为5.9，故可直接上样。

2.2.3 上样速度对吸附量的影响

将上样溶液100 mL通过装有10 g AB-8大孔树脂的吸附柱里，分别以 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min 的流速进行动态吸附，测定吸附后总黄酮的浓度，计算薰衣草总黄酮的饱和吸附量，结果如图3所示。

由图3可知，树脂的吸附容量随流速的增大下降。原因可能要考虑到树脂的内扩散效应，当流速过快，则溶液通过树脂床的速度大于传质速度，总黄酮分子来不及扩散到树脂的内孔就已经流出，从使得树脂的吸附容量减少。因此，在相同条件下，上样流速慢有利于薰衣草黄酮的吸附，即当吸附流速为1.0 mL/min时吸附果最好，因此选择1.0 mL/min的流速进行上柱。

2.2.4 洗脱剂的选择

精密称取4份AB-8树脂，每份10 g，湿法装柱，分别精密吸取薰衣草提取物溶液75 mL溶解后分别上柱，以蒸馏水洗至无色，再分别用30%、50%、70%和95%乙醇溶液150 mL洗脱，分别收集洗脱液浓缩至干。计算总黄酮的纯度和解吸率，总黄酮解吸率=（洗脱液总黄酮量/上柱总黄酮量）×100%，结果见表3。

表3 乙醇浓度对AB-8树脂分离纯化薰衣草总黄酮的影响Table 3 Effects of ethanol concentrations on the desorption of total flavonoids %

由表3可知，以70%乙醇洗脱解吸率最高，总黄酮纯度接近于50%乙醇洗脱物；以95%乙醇洗脱虽然有较高的解吸率，但其总黄酮纯度很低。综合考虑，选择70%乙醇溶液作为薰衣草总黄酮的洗脱剂。

2.2.5 洗脱剂用量的考察

取已吸附好薰衣草总黄酮的AB-8树脂10 g，用蒸馏水洗脱8 BV后，再用70%乙醇溶液洗脱每树脂床体积（15 mL）为一个流分，至洗脱液近无色，分别测定各流分中的总黄酮含量，结果如图4所示，可知，以70%乙醇溶液洗脱，在洗脱2倍柱体积时，总黄酮含量达到最高，随后其含量逐渐降低，5倍柱体积洗脱液便可将绝大部分黄酮洗脱下来，到6倍柱体积含量已经很低，故确定洗脱剂用量为5 BV。

2.2.6 洗脱除杂用水量考察

称取AB-8型干树脂10.0 g，置直径为2.0 cm的洗脱柱中，加入100 mL样品溶液充分吸附后，去离子水以1.0 mL/min的速度洗脱，每15 mL收集一流份，至洗脱液Molish反应呈阴性，且水洗脱各流份分别浓缩干燥至恒重，结果如图5所示。

由图5可知，随着用水量的增加，所得浸膏量（杂质）在不断减少，到6倍柱体积时，大部分杂质被洗脱下来。综合成本考虑，薰衣草水提取物样品上大孔树脂后，以5倍量去离子水除杂。

3 结论

从7种大孔吸附树脂中筛选出来的AB-8树脂对薰衣草总黄酮具有较高的吸附量（静态吸附量达9.563 mg/g树脂），且易于解吸（解吸率为78.17%），动态吸附实验也说明了这一点。动态解吸实验显示薰衣草总黄酮的最大上样量为12.76 mg/mL树脂，吸附流速为1.0 mL/min，70%乙醇较好的解吸能力，解吸率达85.58%，所得总黄酮的含量可达60%以上。该工艺简单易操作、成本低、无污染，适用于薰衣草总黄酮的工业化大生产。

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[1]刘勇民.维吾尔药志上册[M].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1999:394-396

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册[S].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1998:112

[3]Torras-Claveria L,Jauregui O,Bastida J,et al.Antioxidant activity and phenolic composition of Lavandin(Lavandula intermedia EmericexLoiseleur)waste[J].JAgricFoodChem,2007,55(21):8436-8443

[4]吴霞,刘净,于志斌,等.薰衣草中黄酮类化学成分的研究[J].中国中药杂志,2007,32(9):821-823

[5]张纪宁,杨洁.新疆狭叶薰衣草总黄酮抗氧化活性的研究[J].中国食品添加剂,2010(2):162-165