长期远隔后适应对脑缺血再灌注大鼠脑组织神经中丝200表达的影响

闫 峰 刘向荣 赵海苹 王荣亮 吉训明 罗 玫 罗玉敏

(首都医科大学宣武医院脑血管病研究室北京市老年病医疗研究中心，北京100053)

缺血性脑血管病在脑血管病中占绝大多数，对于缺血性脑血管病的保护研究已经成为热点。近来有研究［1-2］报道，基于保护缺血心肌免受再灌注损伤的预适应所产生的远隔后适应可以通过一定方式有效保护卒中脑组织，这种保护是在中风即刻或再灌注即刻给予一次后适应。本实验是在此基础上，观察远隔后适应的长期应用是否与神经中丝(NF)表达有关。NF是神经元特有的结构蛋白，是构成神经元胞体和轴突细胞骨架及维持细胞形态重要的结构蛋白，可反映神经元功能及轴突再生情况。有研究［3］表明，NF200在脊髓损伤中起到修复神经元的作用，但其对缺血性脑损伤的影响鲜有报道。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

SPF级雄性SD大鼠24只，体质量280～300 g，购自北京维通利华实验动物公司〔动物许可证号:SCXK(京)2012-0001〕。饲养于SPF级动物室，自由进食进水。大鼠采用抽签法随机分为4组:①缺血再灌注7 d组(C7，n=6);② 缺血再灌注后适应7 d组(P7，n=6);③ 缺血再灌注 28 d 组(C28，n=6);④缺血再灌注后适应28 d组(P28，n=6)。

1.2 仪器

小动物呼吸机(Harvard Apparatus 683)、双极电凝(德威，DEVEL，ACC100)、显微镜(Carl Zeiss)、反馈式温度调节仪(Harvard Apparatus)、血气分析仪(美国，ABBOTT，i-STAT)、多导生理记录仪 (biopac mp100)、激光多普勒血流仪(PERIMED，PeriFlux System 5000)，显微手术器械。

1.3 动物模型制作

采用改良的Zea Longa法［4］制备大鼠脑缺血再灌注(MCAO)模型。大鼠称体质量后5%恩氟烷混合70%N2O、30%O2诱导麻醉，2%恩氟烷混合70%N2O、30%O2维持麻醉。颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，使用头端直径为0.38 mm的尼龙线栓由颈外动脉残端插入颈内动脉，至距颈内动脉和颈外动脉分叉处约2 cm，缺血时间为2 h。使用反馈式控温毯监测大鼠肛温，将大鼠体温保持于36.5℃ ～37.5℃。分离大鼠尾动脉插入PE-50管持续监测血压，每半小时测一次血气(pH，PO2，PCO2)。术中使用激光多普勒监测脑血流以确保模型的成功。

1.4 远隔缺血后适应方法

动物吸入麻醉后使用橡皮止血带阻断动物双下肢血流，分别于再灌注即刻及实验周期中每天进行1次，每次阻断10 min，开放10 min，循环3次。对照组每次麻醉但不阻断血流。

1.5 Western blotting

每组留取3只大鼠，在缺血再灌注第7天和第28天处死大鼠，留取缺血侧皮质脑组织。提取皮质脑组织蛋白、测定蛋白浓度:脑组织于冰上加入裂解液，用超声波细胞粉碎机进行匀浆，冰浴30 min，使用4℃离心机12 000 r/min，离心30 min，取上清。根据BCA法参照标准蛋白浓度，于560 nm处测定样本的吸光度值(A值)。根据标准蛋白曲线计算各样本的蛋白含量。配制8%分离胶和5%积层胶，取60 μg蛋白样品溶于相应体积的上样液中，水浴锅95℃ ～100℃加热5 min蛋白变性后即刻加样。室温下80 V电泳1 h，蛋白样品到达分离胶后将电压调为100 V，继续电泳约1.5 h。配制电转液，4℃下以90 V 120 min的条件下转至预先用甲醇处理好的NC膜上。将膜置于TBST中清洗3次，每次10 min，置入5%脱脂牛奶中封闭2 h。置入一抗中4℃孵育过夜，次日去掉一抗，TBST清洗3次，每次10 min，再置入二抗中室温孵育1 h。抗体做如下稀释:NF200抗体(1∶1 000，Abcam公司)、β-actin抗体(1∶2 000)、HRP标记山羊抗兔抗体(1∶2 000)。化学发光法检测条带。AlphaE-aseFC软件分析蛋白条带的相对吸光度。

1.6 免疫荧光染色

每组留取3只大鼠，分别在缺血再灌注第7天和第28天处死大鼠，在大鼠脑模具中以视交叉开始冠状位向前及后各留取2 mm厚的脑组织，石蜡包埋，切片，进行免疫荧光染色。步骤如下:脑组织切片依次进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇入水，H2O2/甲醇溶液消除内源性过氧化物酶活性，EDTA抗原微波热修复12 min，小牛血清封闭非特异性抗原1 h;滴加NF200抗体(1∶1 000，Abcam公司);加TRITC山羊抗兔IgG，室温孵育30 min;PBS漂洗3次，每次3 min;DAPI封片，荧光显微镜下观察。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0进行统计分析，所有资料用均数±标准差(±s)表示，各数据组间比较使用单因素方差分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 远隔缺血后适应对大鼠脑缺血NF200含量的影响

如图1所示，P7组大鼠脑组织内NF200表达比C7组显著增高(P＜0.05);P28组大鼠脑组织内NF200表达比C28组及P7组显著增高(P均＜0.05);C28组大鼠与C7组大鼠比较，脑组织内NF200表达差异无统计学意义(P＞0.05)。图2为长期远隔缺血后适应对大鼠脑缺血后脑组织NF200含量影响的定量分析结果。

2.2 大鼠脑缺血NF200蛋白表达免疫荧光结果

为进一步探讨NF200蛋白表达的部位，我们应用免疫荧光染色对NF200/DAPI(代表神经元细胞核)进行了染色，发现缺血损伤后NF200在神经元及轴突中均有表达，实验组的阳性染色神经元及轴突较对照组明显增加，28天后适应组的阳性染色神经元及轴突较7天后适应组的亦明显增加，箭头所指为阳性染色的神经元(图3)。

3 讨论

NF是神经元特有的结构蛋白，特异性的分布于神经元的胞体及突起内，在胞体内多交叉成网。NF根据相对分子质量的不同可分为 NF68、NF160和NF200 3种，其中NF200在正常情况下只存在于轴索中，而胞体不含或很少含有，故正常情况下神经元胞体NF200染色为阴性。脑组织受到损伤时，损伤区域邻近的神经元在创伤刺激及多种诱导因子的作用下，开始大量合成及积存NF200，以适应轴突再生的需要，NF200积存于胞体内而使胞体着色，因此NF200是指示轴突再生状况的一个间接指标［5-7］。

NF200在脊髓损伤中的研究较缺血脑损伤中更为深入，有文献［8］报道，脊髓损伤后由于很多成熟的神经元在轴突损伤后并没有死亡，而再生过程中轴突并无合成蛋白的能力，恢复中的神经元胞体不断合成新的蛋白质及其他产物输向轴突，这些结构是神经再生的基础，在维护神经元的功能和轴浆的转运等方面发挥着重要作用。有研究［9］表明，脊髓损伤后NF200的阳性表达程度与神经功能恢复有着密切的联系。

以往认为神经细胞一旦受到损伤则无再生能力，但目前研究［10-11］认为未成熟脑细胞的可塑性较强，如Kim等［10］发现只要给予受损神经细胞以适当的神经生长因子环境，受损的神经细胞可以再生。之前有研究［12］报道远隔后适应可以增加神经生长因子等一些相关蛋白表达，起到减少缺血造成脑损伤程度的作用。NF200作为神经中间丝，是缺血损伤后神经轴突出芽和再生的重要标志，其表达对细胞骨骼蛋白在细胞正常形态、细胞分化和转化等方面具有至关重要的作用［13］。

根据NF200在脊髓损伤前后变化的特性，本实验观察大鼠脑缺血再灌注损伤后NF200的变化情况，并且观察了大脑中动脉缺血后长时间给予多次肢体远端后适应脑皮质神经元内NF200的变化，发现了与脊髓损伤中相似的情况，即阳染的神经元在损伤区周边神经细胞胞体及轴突内均有分布。根据NF200在神经细胞胞体及轴突中作为细胞骨架的重要成分，我们可以推测脑缺血再灌注损伤后神经元具有自发的轴突再生的潜力，而远隔缺血后适应7天组相对于单纯缺血7天组，远隔后适应28天组相对于单纯缺血28天组NF200表达均有明显的增加，说明长时间多次的远隔缺血后适应有利于损伤的神经纤维再生，而且后适应28天组相对于后适应7天组NF200的表达又有明显的增加，更说明了长期给予远隔缺血后适应可持续的促进神经纤维再生，对神经功能的恢复有更加积极的作用。

图3 免疫荧光染色检测脑缺血大鼠脑组织NF200蛋白的表达及长期远隔后适应的作用Fig.3 Immunofluorescence staining of NF200 in the brain of rats following cerebral ischemia and the effect of remote ischemic post-conditioning in long term(200×)

研究远隔缺血后适应的机制可以帮助我们更好的找到脑缺血时机体的内源性保护机制。本实验提示我们长期多次的给予远隔缺血后适应确实可以对机体产生积极的作用。

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